苹果U6启动子的克隆及功能分析

摘要：

[目的]U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,其可能存在物种特异性因子,且长度不同转录活性存在差异.迄今在苹果(Malus×domestica)上对U6启动子尚缺乏研究.因此,筛选出转录活性高且片段大小合适的苹果U6启动子,可以优化苹果CRISPR/Cas9基因编辑体系.[方法]利用软件DNAMAN以及启动子元件在线分析网站PLACE和plant CARE对苹果U6启动子进行比对分析;克隆并构建U6启动子驱动萤火虫荧光素酶基因(Firefly luciferase,LUC)的融合表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法分别转染苹果愈伤组织和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片;通过检测荧光素酶活性对各U6启动子进行转录活性比较.[结果]苹果基因组中共检索到6条U6 snRNA(E-value<3e-40),分别位于第6、7、9、10、15和17号染色体上,取5′端27 bp snRNA及其上游1500 bp作为候选U6启动子.序列比对结果显示,苹果U6启动子与拟南芥相同,均具有两个保守的元件,包括上游序列元件(Upstream sequence element,USE)和TATA-Like box.瞬时转化后荧光素酶活性检测结果显示,10号染色体上的U6启动子转录活性最高,10号染色体上5′端截短的U6启动子(长度分别为1500、959、275和116 bp)中275 bp的启动子活性最强.另外,在苹果愈伤组织中,苹果U6启动子的转录活性要显著高于拟南芥U6启动子.[结论]从苹果基因组克隆6条U6启动子,并筛选出一条转录活性高且片段长度较短的U6启动子.

关键词：苹果、U6启动子、荧光素酶、本氏烟草、愈伤组织

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分类号：R39;S66

资助基金：国家现代农业产业技术体系建设专项资金CARS-27;中国农业科学院科技创新工程CAAS-ASTIP-2016-RIP -02;辽宁省博士科研启动基金20180540030;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项1610182019007

在线出版日期：2020-01-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：4364-4373