茶树咖啡碱合成酶基因稀有等位变异TCS1g的筛选、克隆及功能

摘要：

[目的]茶树咖啡碱合成酶1(TCS1)是山茶属(Camellia)茶组植物咖啡碱合成的关键酶,TCS1具有丰富的等位变异.从我国丰富的茶树种质资源中发掘TCS1稀有等位变异并研究其功能,深入解析茶树咖啡碱合成机制,为低咖啡碱育种提供新的基因资源.[方法]利用特异引物TCS1P InDe1 F/R对67 3份茶树资源中的TCS1等位变异进行鉴定;使用引物TCS1cDNAF/R,从含有新稀有等位变异的茶树资源中克隆基因的cDNA全长序列;利用生物信息学、实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和原核表达等方法研究新发现稀有等位基因的功能.[结果]在部分大理茶(C.taliensis)资源中鉴定到一个新的TCS1稀有等位变异,命名为TCS1g.从大理茶资源‘龙陵17’(LL17,含有的TCS1等位变异为TCS1a和TCS1g)中克隆了TCS1g.TCS1g的编码区序列全长为1 098 bp,编码365个氨基酸,编码蛋白的分子量和理论等电点分别为40.9 kD和5.1.序列比对结果表明,TCS1g与TCS1a、TCS1b、TCS1c、TCS1d、TCS1e、TCS1f的相似度在94.1％-99.2％;与具有可可碱合成酶活性(TS)的TCS1b和TCS1c编码蛋白序列相似度均大于96.7％,而与同时具有TS和咖啡碱合成酶(CS)活性的TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f相似度都小于95.4％,且TCS1g第221位氨基酸残基与TCS1b、TCS1c同为组氨酸(His),而TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f为精氨酸(Arg).第221位氨基酸残基位于TCS1g蛋白活性中心,该位点的突变(His突变为Arg),可以导致TCS1g的等电点(5.05变为5.06)和亲水性(-0.119变为-0.123)发生改变.此外,5'上游调控区域的比对结果显示TCS1g、TCS1b、TCS1c起始密码子(ATG)比TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f延后了15 bp.豫该表达发现TCS1g具有TS活性,活性为44.3 pkat/mg,但未检测到CS活性.qRT-PCR的结果表明LL17中等位变异TCS1g有表达.LL17的咖啡碱和可可碱的含量分别为40.3 mg·g-1和5.4 mg·g-1.[结论]鉴定并克隆了一个新的TCS1稀有等位变异TCS1g,其在LL17中具有一定的表达水平,且其表达蛋白具有TS活性,而未检测到CS活性;推测决定TCS1g仅具有TS活性的关键位点是第221位氨基酸残基.

关键词：等位变异、咖啡碱合成酶、功能分析、嘌呤生物碱、茶树

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资助基金：国家自然科学基金31670685;国家茶叶产业技术体系CARS-19;中国农业科学院科技创新工程CAASASTIP-2017-TRICAAS

在线出版日期：2019-06-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：1772-1783