大载体转染猪胎儿成纤维细胞的电转条件优化

摘要：

[背景]随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义.在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维(porcine Fetal Fibroblasts,PFFs)细胞的转染效率有关.[目的]研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构三方面,比较3种电转仪ECM(R) 830/NEPA21/NucleofectorTM2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件.[方法]使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1x106个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构三方面分别比较瞬时转染效率.[结果]首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEFA 21转染PFFs的效率最高,为13.24％±1.63％,而NucleofectorTM2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36％±3.95％.然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM(R) 830和NucleofectorTM2b转染PFFs的最佳质粒用量为12 μg,其转染效率分别为8.44％±0.90％(电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次)和14.63％±3.21％(电转参数:U-023),而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高(6.09％±0.72％).最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96％-48.39％.[结论]因此NucleofectorTM 2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12 μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10 μg超螺旋质粒;ECM(R)830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12 μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率.综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是NucleofectorTM 2b.

关键词：电转染、大载体、猪胎儿成纤维细胞、ECM(R)830、NEPA 21、NucleofectorTM 2b

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资助基金：国家科技重大专项2016ZX08006002;国家自然科学基金31802036;广东省自然科学基金2017A030310001

在线出版日期：2019-04-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：530-538