飞蝗双链RNA降解酶的抗体制备及组织定位

摘要：

[目的]双链RNA降解酶(dsRNA degrading enzyme,dsRNase)是制约RNA干扰(RNAi)技术在害虫防治中应用的关键因素之一.本研究旨在利用原核表达系统获得飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3的特异抗原,进而制备抗体,对其进行组织定位和蛋白表达量检测,为进一步解析飞蝗中肠dsRNA降解酶基因的功能分化提供蛋白水平的证据.[方法]通过对LmdsRNase2和LmdsRNase3的氨基酸序列(GenBank:ARW74135.1和ARW74134.1)进行比对,分别选取特异的LmdsRNase2和LmdsRNase3抗原序列(R2'、R3')进行后续的研究.根据LmdsRNase2和LmdsRNase3的eDNA全长序列,设计包含酶切位点BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的引物,采用PCR技术扩增目标片段,双酶切后连接至pET-32a载体.将重组质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中,加入IPTG至终浓度为0.5mmol·L-1,37℃下诱导4h后提取蛋白,采用SDS-PAGE电泳方法检测蛋白表达.大量培养带重组质粒的大肠杆菌,诱导目的蛋白大量表达,用镍柱亲和层析法分离R2'和R3'蛋白,Bradford法检测蛋白浓度.经两次免疫新西兰大白兔后,最终获得LmdsRNase2和LmdsRNase3的多克隆抗体.利用ELISA法测定多克隆抗体的效价,通过Westernblot检测抗体的特异性.提取飞蝗5龄第3天的中肠组织蛋白和中肠液,分别用LmdsRNase2和LmdsRNase3的抗体检测其表达量.最后制备飞蝗5龄第3天的中肠石蜡切片,通过免疫组化对LmdsRNase2和LmdsRNase3蛋白进行亚细胞定位.[结果]通过氨基酸序列比对发现,LmdsRNase2和LmdsRNase3具有37％的序列一致度,选取特异的序列R2'和R3'设计引物,分别包含157和153个氨基酸残基,理论分子量分别为17.0和16.8 kD.在IPTG浓度为0.5 mmol·L-1条件下,37℃诱导4h后,目的蛋白在包涵体中大量表达.扩大培养重组菌株后提取蛋白,用镍亲和层析柱分离得到纯度为85％的R2'蛋白,可直接用于免疫;而R3'蛋白的纯度低于85％,利用电泳切胶纯化后免疫新西兰大白兔,36 d后取抗血清进行检测,效价均达到1:102 400,表明抗体效果良好.用多克隆抗体杂交实验室保存的His-LmdsRNase2和His-LmdsRNase3融合蛋白,对抗体进行特异性检测,结果表明R2和R3的抗体分别特异性识别LmdsRNase2和LmdsRNase3,无交叉杂交现象,且条带与His抗体杂交到的条带大小一致.采用Western blot方法检测,发现LmdsRNase2蛋白在中肠组织中高表达,但在中肠液中未检测到可见表达,LmdsRNase3蛋白在中肠组织和中肠液中均未检测到表达.进一步采用免疫组化方法对两个蛋白进行组织定位,发现LmdsRNase2和LmdsRNase3均在中肠细胞质中表达,但LmdsRNae3的表达量较低.[结论]成功制备了特异性良好的飞蝗LmdsRNase2和LmdsRNase3抗体,Western blot和免疫组化分析表明LmdsRNase2在中肠细胞质中高表达,而LmdsRNase3的表达量很低.研究结果为飞蝗中肠两个dsRNA降解酶LmdsRNase2和LmdsRNase3的功能分化提供了蛋白水平的证据.

关键词：飞蝗、dsRNA降解酶、多克隆抗体、组织定位

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资助基金：国家自然科学基金31601697,31730074

在线出版日期：2018-11-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：3704-3713