烟草NbbZIP28突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

摘要：

[目的]bZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程.前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERs)因子NbbZIP28;NbbZIP28沉默导致病毒积累量上升,本研究旨在验证NbbZIP28对病毒侵染胁迫的响应机制.[方法]通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和烟草遗传转染创建NbbZIP28基因突变植株,以野生型植株为对照,分别浸润接种侵染性克隆TMV-GFP、摩擦接种TMV-GFP或CMV接种液,检测突变体植株对病毒侵染胁迫的敏感性变化,接种CMV后0-48 h,采用qRT-PCR检测内质网应激相关的未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)基因的表达.本氏烟接种TMV 24 h、接种CMV 48 h后,在接种叶上浸润融合蛋白NbbZIP28-GFP,瞬时表达48 h后,采用Western blot检测病毒诱导NbbZIP28蛋白的水解激活;采用在线搜索工具PlantCARE分析NbbZIP28启动子区域中参与防卫和应激反应的顺式作用元件.[结果]CRISPR/Cas9定点敲除NbbZIP28后,目的基因靶位点缺失了1 0个碱基,导致翻译错误、蛋白功能变化.在正常生长条件下,转基因阳性植株与野生型无显著的表型差异.植株接种TMV-GFP后4-8 d,突变体中的病毒浸润斑亮度或初侵染点数目均显著高于野生型,扩展至新叶的速度较快.接种CMV后12-48 h,突变体中UPR相关基因BiP、PDI、CAM及NbbZIP28下游基因NF-YC2的表达量显著低于野生型;5-7d突变体中的病毒外壳蛋白(coat protein,CP)基因表达量显著高于野生型,花叶及皱缩症状更显著.蛋白质序列比对分析显示NbbZIP28具有与拟南芥AtbZIP28相同的S1P和S2P蛋白酶水解位点.Western blot检测发现,与接种清水对照相比,TMV或CMV侵染显著促进了全长的融合蛋白NbbZIP28-GFP在S1P和S2P位点发生裂解.NbbZIP28启动子序列中包含5个参与热应激反应的顺式作用元件(heat stress response element,HSE)、3个参与低温反应的顺式作用元件(low temperature response element,LTR)、1个参与防卫和应激反应的顺式作用元件(TC-rich repeats).[结论]病毒侵染促进NbbZIP28的水解激活并上调相关的UPR基因;NbbZIP28敲除导致植株对病毒的敏感性上升,病毒诱导的UPR基因表达被抑制.NbbZIP28为病毒侵染胁迫下的UPR调控因子,在病毒侵染早期通过上调UPR信号和提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的侵染和增殖.

关键词：内质网应激、未折叠蛋白应答、NbbZIP28、病毒侵染、烟草

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资助基金：中国农业科学院科技创新工程ASTIP-TRIC04;山东省现代农业产业技术体系烟草产业创新团队SDAIT-25-03

在线出版日期：2018-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：2689-2699