一种高通量提取桃DNA方法的建立与应用

摘要：

[目的]DNA制备是大规模基因型筛选和分子标记辅助选种的重要前提,本研究采用一种1.2 mL八联排管代替单个离心管,探索一种操作简便、节约时间、成本低的桃DNA快速提取方法,以满足高通量遗传研究的需求,提高工作效率.[方法]以普通生长型桃(standard type,ST)‘中油桃8号’为母本,温度敏感半矮生型桃(temperature-sensitive semi-dwarf in Prunus persica,PpTssd)‘09-1-112’为父本,杂交获得F1代分离群体500株实生苗为载体,包括温度敏感半矮生型246株,普通生长型254株,建立一种高通量、低成本桃DNA提取方法.利用1.2 mL八联排管结合八通道移液器,简化提取步骤,提取桃幼嫩叶片中的基因组DNA;通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA浓度、纯度和完整性进行检测.基于高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM),采用96孔板对温度敏感半矮生型桃和普通生长型桃共500个F1分离后代单株进行PCR扩增和基因分型,区分TSSDtssd基因型与tssdtssd基因型.基于双亲表型与基因型一致,开发InDel位点,PCR扩增后,采用SDS-PAGE在F1群体中进行验证,确定利用分离的DNA是否正确区分不同基因型.[结果]分离的DNA经紫外分光光度计检测,浓度范围约为25-200 ng·μL-1,OD260nm/OD280nm约为1.81-1.98,DNA纯度较高;琼脂糖凝胶电泳条带清晰、单一,DNA完整度较高.参考桃基因组(Version 2.0),根据双亲深度测序数据,开发获得SNP标记SNP_Pp03 3758620,应用于高分辨率熔解曲线基因分型,发现温度敏感半矮生型和普通生长型呈现明显不同的峰型,证明提取的DNA模板可应用于HRM基因分型.基于双亲基因型与表型一致,开发InDel标记InDel_Pp03_3829009,聚丙烯酰胺凝胶电泳的验证结果显示PCR扩增具有较高的强度,获得与目的片段大小一致的特异性条带,且在两种不同生长型单株中具有明显的多态性,表明PCR扩增稳定,提取的DNA可用于基于InDel标记的多态性分析.使用该提取方法,每人每天可以完成1 000个样品的DNA提取,成本较低,且不会对幼苗早期生长造成影响.[结论]建立了一种简便、有效、低成本的桃基因组DNA提取方法,可以满足基因分型、品种鉴定及遗传分析等分子生物学研究,实现了大批量不同样本基因组DNA的同时提取,具有较高应用价值.

关键词：桃、高通量、DNA提取方法

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资助基金：国家自然科学基金31500558;河南省重点研发专项182102110134;中国农业科学院科技创新工程专项经费CAAS-ASTIP-2018-ZFRI

在线出版日期：2018-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：2614-2621