慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞BMPR-IB基因及BMPs信号通路重要基因表达分析

摘要：

[目的]利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB(bone morphogenetic protein receptor,type IB)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响.[方法]针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.mit.edu获得了21条sgRNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sgRNA与互补序列(包含接头)退火成双链后连接入线性化的lentiCRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒psPAX2和pCMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒.慢病毒溶液经0.45μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6μg·mL-1,在1000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h.感染3 d后,细胞在含3.5μg·mL-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群.针对编辑(打靶)细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况.利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量.利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力.[结果]T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70％.针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10％(2/20)的脱靶情况.RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、CylinD2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降(P<0.01).Western blotting结果显示,打靶细胞BMPR-IB基因的表达量较对照组细胞降低62％.CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞(P<0.01);打靶细胞中,随着传代的(P5、P7和P9)增加其增殖能力极显著下降(P<0.01),而对照组细胞不同代次间细胞增殖能力无显著差异(P>0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响.[结论]慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在BMPR-IB基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用.

关键词：慢病毒、CRISPR/Cas9、猪胎儿成纤维细胞、BMPR-IB、脱靶、细胞增殖

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资助基金：国家自然科学基金31560304;国家科技重大专项2016ZX08006-003

在线出版日期：2018-06-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：1378-1389