赤拟谷盗章鱼胺受体3(TcOctβR3)cDNA克隆、表达及功能

摘要：

[目的]章鱼胺信号系统在调节昆虫行为和生理过程中具有至关重要的作用.赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为一种模式昆虫,被广泛用于解析昆虫生长发育及生理等调控机制的研究工作.本研究以赤拟谷盗为对象,旨在明确章鱼胺受体在调节赤拟谷盗行为和生理方面的功能.[方法]根据GenBank登录的相关序列信息(XP_008198078),利用RT-PCR技术克隆赤拟谷盗章鱼胺受体基因TcOctβR3的cDNA序列.利用在线生物信息学分析软件预测该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列以及跨膜结构域等信息,基于邻接法构建该基因与其他昆虫相关序列的系统发育树,明确系统进化关系.分别提取赤拟谷盗各发育阶段(卵、幼虫、蛹和成虫)、不同组织(中枢神经系统、脂肪体、中肠、后肠、马氏管、精巢和卵巢)以及饥饿胁迫后的RNA,以赤拟谷盗核糖体蛋白S3(TcRPS3)为内参基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在赤拟谷盗不同发育阶段、不同组织以及在饥饿胁迫下的表达模式.运用哺乳动物异源表达系统在人胚胎肾细胞HEK293中瞬时表达TcOctβR3,进而利用第二信使cAMP含量测定技术分析TcOctβR3与配体的结合能力.最后,通过体外合成赤拟谷盗TcOctβR3的双链RNA,利用RNA干扰以及轨迹球行为分析等技术探究该基因的生理功能.[结果]序列分析结果表明,赤拟谷盗TcOctβR3开放阅读框全长1305 bp,编码434个氨基酸,序列中含有G蛋白偶联受体典型的7个跨膜结构域.基于邻接法构建的系统发育树表明,该基因编码的蛋白质与小蜂甲(Aethina tumida)的OctβR3亲缘关系最近.实时定量PCR分析结果表明,TcOctβR3在赤拟谷盗各发育阶段均有表达,尤其在低龄幼虫期转录水平最高,而在其他发育阶段表达量无显著差异;在赤拟谷盗不同组织中,TcOctβR3在中枢神经系统的表达量显著高于其他组织;赤拟谷盗幼虫在经饥饿处理24 h的过程中,TcOctβR3的表达量呈先下降后上升的趋势,且在处理6 h的表达量最低,为对照的0.47倍,在16 h表达量最高,为对照的1.80倍,最后恢复到正常水平.通过HEK293细胞异源表达TcOctβR3后,cAMP测定结果表明章鱼胺(OA)呈浓度依赖性地激活TcOctβR3,其EC50为8.68×10-7 mol·L-1,萘甲唑啉(NA)的激动活性最高,其有效中浓度EC50为8.56×10-8 mol·L-1.4种供试生物胺激动剂活性强弱为:萘甲唑啉>酪胺(TA)>章鱼胺>多巴胺(DA).进一步采用RNA干扰技术的分析结果表明,注射dsRNA能有效抑制TcOctβR3的表达,沉默效率高达61.5％,但干扰该基因表达后不会影响赤拟谷盗成虫的爬行速度和产卵量.[结论]TcOctβR3在赤拟谷盗中枢神经系统可能发挥重要作用,能调节幼虫对饥饿胁迫的响应.明确了TcOctβR3的分子生物学特性,可为将来以其为靶标筛选高效激动剂和抑制剂提供理论依据.

关键词：赤拟谷盗、章鱼胺受体、表达模式、生物活性、生理功能

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资助基金：国家自然科学基金面上项目31772233

在线出版日期：2018-06-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：1315-1324