桑树谷氨酸脱氢酶基因MaGDHs的克隆及表达分析

摘要：

[目的]克隆桑树的谷氨酸脱氢酶基因GDH,了解其结构、组织特异性表达以及调控特点,并获得桑树谷氨酸脱氢酶蛋白,为进一步研究谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)在桑树氮代谢过程中的功能奠定基础,也为多年生木本植物的GDH研究提供参考.[方法]根据川桑基因组数据库搜索GDH同源序列设计引物,以杂交桑品种桂桑优62号(M.atropurpurea Roxb.)cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得MaGDHs.利用NCBI上BLAST和CDD进行氨基酸序列比对和保守结构域分析;利用Expasy在线软件对MaGDH氨基酸组成、分子量、等电点进行分析;采用MEGA 5.0软件构建系统进化树;通过qRT-PCR检测试管苗在不同浓度的蔗糖、铵盐、激素(6-BA)状态下MaGDHs的表达量,用StepOne Software V2.1软件根据2△△Ct法进行基因相对表达量分析.以pET-28a(+)、pET-32a(+)、pCold-TF为载体构建MaGDH的融合蛋白重组质粒并转入到大肠杆菌中进行表达.[结果]成功获得2个MaGDHs,序列全长均为1 236 bp,编码411个氨基酸,含一个开放阅读框,分别命名为MaGDH1和MaGDH2. MaGDH1蛋白质的分子量为44.1 kD,理论等电点为5.84,MaGDH2蛋白质的分子量为44.2 kD,理论等电点为6.68. MaGDHs氨基酸序列含有9个外显子,8个内含子,具有线粒体转移肽、Glu/a-KG结合域和NAD (P)结合域,与川桑同源性均为99％,与双子叶植物同源性为90％左右,与单子叶植物的同源性为85％左右.重组蛋白MaGDHs以包涵体的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,经过纯化和复性后获得了具有活性的酶蛋白,酶活性以pET-28a (+)-MaGDH1重组蛋白最高,为10.07 nmol·min-1·mL-1. MaGDHs的表达具有组织特异性,在桑花中表达量最高,其次是嫩叶,在果实中几乎不表达.MaGDHs的表达受到蔗糖、NH4+和6-BA的调控.随着蔗糖浓度的增加,MaGDHs表达量增加;过量的NH4+促进MaGDH1的表达,而没有NH4+的情况下,MaGDHs也有表达;细胞分裂素对MaGDHs的表达是先抑制后促进,MaGDH在24 h后表达增强,MaGDH2在48 h后表达增强.[结论]从桂桑优62号中获得了两个MaGDHs,分别编码p和α亚基.不同载体的重组蛋白酶活性存在差异.MaGDHs的表达具有组织特异性,在桑树生长旺盛的组织中表达量较高.过量NH4+促进MaGDH1表达;MaGDH1响应激素促进表达比MaGDH2早.

关键词：桑树、谷氨酸脱氢酶、组织表达、原核表达、调控

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资助基金：国家蚕桑产业技术体系建设专项CARS-18-ZJ0201;中央高校基本科研业务费XDJK2017D116

在线出版日期：2018-05-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：758-769