基于单链置换的环介导间接PCR鉴别PEDV、TGEV方法的建立及应用

摘要：

[目的]猪病毒性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 所引起的一种急性肠道传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水、高发病率和死亡率为主要特征.PEDV与 TGEV同属α 冠状病毒,可以感染各年龄段猪只,尤其对仔猪的危害最为严重,可导致大量仔猪死亡,给养殖业造成严重经济损失.由于PEDV和TGEV感染在临床症状、病理变化和流行病学上极为相似,临床上很难区分,因此,建立一种高效、特异的临床鉴别诊断方法对于预防病毒性腹泻的爆发流行具有重要意义.本试验旨在建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)环介导间接PCR检测方法,用于猪病毒性腹泻的病原学鉴别诊断.[方法]根据GenBank数据库中PEDV和TGEV基因组序列信息,在对两种病毒基因序列同源性比较的基础上,分别选取PEDV和TGEV核蛋白(N)基因序列的一段高度保守区,设计两条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的TOC1基因片段两端,作为特异性标记的报告基因.此报告基因与待测靶标基因经杂交、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立PEDV/TGEV鉴别诊断方法,扩增片段大小分别为404、252bp.[结果]该方法特异性好,可单独或同时检测PEDV和TGEV,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型轮状病毒(RAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等常见猪源性病毒无交叉扩增;检测灵敏度高,对PEDV和TGEV的最低极限浓度分别为1.6和8 pg·μL-1的核酸样品,两种病原的同时检测不影响检测灵敏度;采用环介导间接PCR、常规RT-PCR和SybrGreen实时PCR对157份临床样本进行比较检测,3种方法的PEDV 检出率分别为33.76%、21.66%和36.31%,TGEV检出率分别为26.75%、13.38%和28.03%;kappa检验结果,环介导间接PCR、SybrGreen实时PCR两种方法对PEDV和TGEV检测结果的符合度均为96.18%(κ≥0.90)[结论]环介导间接PCR可以用于鉴别诊断PEDV/TGEV,是一种快速、准确、灵敏、特异的病原学诊断工具.

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、环介导间接PCR、探针、报告基因

所属期刊栏目：50

分类号：S85;TQ3

资助基金：河南省科技开放合作项目152106000010;河南省教育厅科技攻关项目13A230382

在线出版日期：2018-01-17（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：4790-4798