MiR-433-3p靶向调节绵羊BCKDHB表达

摘要：

[目的]通过理论预测与试验验证,旨在揭示miR-433-3p对BCKDHB的调节机制.[方法]利用TargetScan、miRanda和DIANA-microT 3个在线软件,以BCKDHB的序列预测与BCKDHB有靶标关系的相关miRNAs.为了验证理论上的预测结果,用设计好的BCKDHB 3'-UTR的特异性引物进行PCR扩增,得到目的片段并进行割胶回收和纯化,并将Pmir-GLO与目的片段同时使用XhoⅠ和Xba Ⅰ两个限制性内切酶进行双酶切,再用T4连接酶连接双酶切之后的目的片段和Pmir-GLO,成功构建BCKDHB3'-UTR的双荧光素酶报告载体.从公司购买miR-433-3p的过表达载体mimics和阴性对照载体NC,设置miR-433-3p过表达、阴性对照、空白对照3个组,分别将2组载体和双荧光素酶报告载体利用lipofectamineTM3000转染试剂共转染至miR-433-3p过表达、阴性对照组的HEK-293T细胞中,空白对照组中的HEK-293T细胞正常培养,之后分别检测3组细胞中的荧光活性,得到萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性,以海肾荧光素酶活性为内参计算萤火虫荧光素酶的相对活性.便于了解miR-433-3p和BCKDHB在绵羊前体脂肪细胞中的调控机制,对采取的绵羊尾部前体脂肪细胞进行离体培养.用过表达miR-433-3p的方法探索miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB的调控,提取过表达miR-433-3p前后细胞的总RNA和总蛋白,利用RT-qPCR检测过表达miR-433-3p前后的miR-433-3p和BCKDHB mRNA的表达量、以及利用Western blotting技术检测BCKDHB在过表达前后的蛋白水平.为了解绵羊前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p表达量的变化,用RT-qPCR检测前体脂肪细胞分化过程中BCKDHB和miR-433-3p的时序表达.为增加结果的可信度,还对分化过程中不同时段的细胞进行了照片采集和油红0染色.[结果]miR-433-3p在BCKDHB 3'-UTR的第8--28个碱基处存在理论上的结合位点.通过比较过表达组,阴性对照组,对照组的相对荧光活性发现过表达miR-433-3p后,BCKDHB 3'-UTR重组双荧光载体的相对荧光活性降低(P＜0.01),说明miR-433-3p可以与BCKDHB 3'-UTR特异性结合,验证了预测结果的准确性.在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-433-3p后,通过比较过表达组和阴性对照组BCKDHB的mRNA和蛋白的相对表达量,发现过表达组BCKDHB mRNA和蛋白的相对表达量低于阴性对照组(P＜0.05),说明miR-433-3p在绵羊前体脂肪细胞中对BCKDHB有负调控作用.在诱导绵羊前体脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程中,从采集到的图片和油红0染色的结果发现此过程中脂滴聚积得越来越多,油红0染色验证了脂滴的聚集.另外,在分化过程中检测到miR-433-3p和BCKDHB mRNA的表达量呈现负相关关系.[结论]这些结果充分说明miR-433-3p通过与BCKDHB 3'-UTR的结合负调节该基因及其编码蛋白的表达,为进一步研究BCKDHB调节绵羊脂肪代谢的分子机理提供了科学依据.

关键词：miR-433-3p、BCKDHB、绵羊、前体脂肪细胞、细胞分化

所属期刊栏目：50

分类号：S85;S81

资助基金：国家自然科学基金31372292;山西优势肉用家畜高效安全生产协同创新中心项目

在线出版日期：2018-01-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：4389-4397