甜菜夜蛾卵黄原蛋白多克隆抗体制备及其在不同发育时期蛋白表达

摘要：

[目的]制备甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)多克隆抗体,并检测甜菜夜蛾不同发育时期血淋巴中的Vg蛋白表达量变化,为进一步研究Vg转运与利用机制以及生物学功能打下基础.[方法]以羽化24 h的甜菜夜蛾雌成虫eDNA为模板,通过PCR扩增得到甜菜夜蛾Vg基因片段,其包含vitellogenin-N结构功能区.将Vg目的片段连入pMD-19T载体后进行测序,利用DNAMAN软件分析该基因序列的准确性及编码蛋白的特性.将测序正确的Vg基因片段通过NdeⅠ和XbaⅠ限制性内切酶连接到原核表达载体pCzn1.将重组表达载体pCzn1-Vg转入大肠杆菌hrcticExpress,离心收集诱导表达的菌液,超声波破碎菌体沉淀,取上清液与沉淀进行SDS-PAGE检测,分析Vg重组蛋白的可溶性.在不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白,筛选最优表达条件.经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了Vg重组蛋白,将该蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗Vg血清抗体.采用间接ELISA方法检测血清抗体的效价,并通过Western blot法检测甜菜夜蛾雌虫不同发育阶段血淋巴中Vg蛋白的表达差异.[结果]扩增所得Vg基因片段为2 091 bp,编码697个氨基酸,预测蛋白分子量为80.88 kDo通过大肠杆菌表达出的Vg重组蛋白相对分子量为80 kD,其大小与预期的Vg重组蛋白带大小相符合.其主要以包涵体形式表达,而在上清中表达量不明显.不同温度、不同浓度IPTG条件下诱导表达Vg重组蛋白的结果显示温度为25℃,[PTG浓度为0.6 mmol·L-1时,Vg重组蛋白表达量最高.继续提高温度和IPTG浓度,对提高Vg重组蛋白的表达量无明显作用,且杂蛋白增多.新西兰白兔经4次免疫后,间接ELISA法检测表明,制备的兔抗Vg抗体具有较好的灵敏度,效价达到1∶512 000.Western blot检测Vg蛋白在甜菜夜蛾不同发育阶段血淋巴中的表达,其杂交出的单一条带在180 kD左右.Vg蛋白在甜菜夜蛾雌蛹末期开始微弱表达.雌成虫羽化后血淋巴中Vg蛋白表达量先升高后降低,呈动态变化,到羽化48h表达量最高,随后降低.[结论]纯化获得了Vg重组蛋白,并明确了最优表达条件(温度为25℃,IPTG浓度为0.6 mmol·L-1);制备了高效价的甜菜夜蛾Vg多克隆抗体,明确了甜菜夜蛾Vg蛋白的表达规律.

关键词：甜菜夜蛾、卵黄原蛋白基因、原核表达、抗体制备、表达模式

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分类号：R38;X50

资助基金：国家重点研发计划6111661;国家现代农业产业技术体系CARS-18-16;江苏省农业科学院院基金计划6111612;国家公益性行业农业科研专项201303028;江苏省食品质量安全重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地自主研究课题3201632

在线出版日期：2018-01-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：4316-4324