超表达苹果细胞分裂素响应基因MdCRF6影响花青苷积累和盐胁迫抗性

摘要：

[目的]克隆苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF6(cytokinin response factor 6),鉴定其在调节花青苷积累和盐胁迫抗性中的作用,揭示MdCRF6的功能,为研究细胞分裂素信号途径和果树生长发育调控提供理论依据.[方法]以‘嘎啦,苹果(Malus domestica ‘Gala’)为研究材料,利用同源序列比对和PCR技术,分离细胞分裂素响应基因MdCRF6.使用MEGA 5.0软件构建苹果MdCRF6与拟南芥CRFs间系统进化树;通过SMART软件和DNAMAN软件分析MdCRF6蛋白的保守结构域.利用实时荧光定量PCR方法检测该基因对细胞分裂素和盐胁迫的响应.通过电泳迁移率试验(EMSA),验证MdCRF6原核表达蛋白对DRE作用元件的绑定.构建MdCRF6植物超表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化获得转MdCRF6苹果愈伤组织.比较野生型和转基因苹果愈伤组织在花青苷积累和盐抗性方面的差异,结合基因表达分析,初步鉴定MdCRF6在调节花青苷积累和盐胁迫方面的生物学功能.[结果]分离得到了苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF6(基因序列号:MDP0000783818),该基因开放阅读框(ORF)为1 047 bp,编码含有348个氨基酸的蛋白.进化树分析和氨基酸序列比对结果表明,苹果MdCRF6蛋白在N端包含保守的CRF结构域,在C端包含保守的AP2/ERF结构域,并且与拟南芥AtCRF6同源性最高.基因表达分析显示该基因具有细胞分裂素和盐胁迫响应,分别在10 μmol·L-1 BA和100 mmol·L-1 NaCl处理3h和6h时表达量最高.EMSA试验结果验证MdCRF6原核表达蛋白能够绑定DRE序列.在苹果愈伤组织中超表达MdCRF,发现MdCRF6转基因苹果愈伤组织花青苷积累受到抑制,同时苹果愈伤组织的抗盐性降低.基因表达分析显示,MdCRF显著抑制花青苷合成基因和盐响应相关基因的表达.[结论]苹果MdCRF6与拟南芥AtCRF6具有高度的同源性,其参与植物对细胞分裂素和盐胁迫的响应.在苹果愈伤组织中超量表达MdCRF6抑制其花青苷积累,降低植物抗盐性.推测苹果MdCRF6可能通过结合花青苷合成基因以及抗盐相关基因的启动子,抑制基因的表达,从而负调节花青苷积累和抗盐性.

关键词：苹果、MdCRF6、花青苷、盐胁迫

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分类号：R73;S5

资助基金：国家自然科学基金31601742;教育部创新团队支持计划IRT15R42;山东省现代农业产业技术体系SDAIT-06-03

在线出版日期：2017-11-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：3196-3204