大豆组成型三重反应基因GmCTR1的克隆与功能分析

摘要：

[目的]植物激素乙烯参与植物的生长发育以及生物与非生物胁迫过程.组成型三重反应基因CTR1作为乙烯受体下游一个负调控因子,结合乙烯受体共同参与乙烯的信号转导途径.本研究通过对大豆(G1ycine max)的组成型三重反应基因CTR1进行克隆和诱导表达分析,以及在大豆发状根中过表达该基因后进行疫霉根腐病的抗性分析,探究CTR1在大豆与疫霉菌互作过程中的功能[方法]利用同源克隆的方法,以拟南芥的AtCTR1序列为探针,在大豆基因组数据库中搜索同源性最高的基因即为大豆的GmCTR1(G1yma.13G151100,并从Williams82中将GmCTR1克隆出来.对GmCTR1进行多重序列比对、系统进化分析和疫霉菌的诱导表达分析.构建植物过表达载体pBinGFP2:GmCTR1.应用发根农杆菌介导的遗传转化方法获得大豆发状根,经GFP荧光筛选得到大豆过表达GmCTR1的阳性发状根和转入空质粒的阴性对照发状根.对过表达GmCTR1发状根和阴性对照发状根侵染疫霉菌后,检测病斑长度、疫霉生物量和抗性相关基因的表达.[结果]根据同源序列比对结果,将与拟南芥AtCTR1(AT5G03730)同源性最高(75.3％)的大豆基因G1yma.13G151100命名为GmCTR1,从Williams82中克隆得到GmCTR1的CDS序列.该基因的CDS序列全长2 511 bp,编码836个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,蛋白质量为92.35 kD,等电点为6.51.多重序列比对结果显示,GmCTR1氨基酸具有CTR1同源蛋白的典型结构域和关键特征.构建系统发育树进行进化分析发现,GmCTR1与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的CTR1亲缘关系十分相近,在同一个分支上,且与菜豆的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果表明,在大豆疫霉菌P6497侵染后,GmCTR1受诱导逐渐上调表达,在侵染48 h后表达水平达到最高,随后表达量降低.利用酶切连接方法将GmCTR1的CDS序列构建到植物过表达载体pBinGFP2中,PCR和酶切验证获得了重组质粒pBinGFP2:GmCTR1.对发状根接种疫霉菌后发现,过表达GmCTR1减弱了对疫霉根腐病的抗性,疫霉菌侵染36 h后过表达发状根与对照相比病斑长度显著增长.过表达GmCTR1发状根中疫霉菌的生物量与对照相比增加,与大豆抗病反应相关基因的表达水平显著降低.[结论]GmCTR1在大豆与疫霉菌的互作过程中发挥一定的负调控作用.

关键词：大豆、GmCTR1、表达分析、疫霉根腐病抗性、大豆发状根

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分类号：S43;R31

资助基金：国家公益性行业农业科研专项201303018;转基因生物新品种培育重大专项2011ZX08004;长江学者和创新团队发展计划PCSIRT13073;大豆现代产业技术体系CARS-004-PS10;江苏省现代作物生产协同创新中心

在线出版日期：2017-11-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：3082-3091