西瓜细菌性果斑病菌鞭毛基因fliS的功能分析

摘要：

[目的]西瓜细菌性果斑病由西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli,Ac)引起,是一种严重的世界性病害.细菌的鞭毛通常被认为是细菌的运动器官,在细菌的侵染过程中也起重要作用,已有报道表明这种作用可受鞭毛蛋白基因fliS的调控,目前西瓜细菌性果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS的功能及其调控机理尚不清楚,本研究旨在探讨该基因在鞭毛形成和致病性等生物学特性中的作用.[方法]以果斑病菌野生型致病菌株1号基因组DNA为模板,设计一系列引物,PCR扩增敲除基因fliS的上下游片段,通过回收、酶切、连接、转化等步骤构建敲除载体和互补载体,然后采用三亲杂交法,根据同源重组的原理,构建fliS基因缺失突变菌株及其互补菌株,并对其鞭毛的形态特征、致病性、过敏反应、游动性、群体感应、菌膜、生长速率、菌落形态等生物学特性进行测定;进一步提取细菌总RNA,以谷氨酰胺合成酶基因glnA为参照来校正目标基因的表达量,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,比较野生菌株、敲除菌株和互补菌株部分鞭毛蛋白基因flhD、fliE、fliC、flgK、flgM、fliD和fliA的表达量差异.[结果]通过抗性基因Gm的筛选和PCR验证,成功构建了果斑病菌鞭毛蛋白基因fliS缺失突变菌株1-fliS及其互补菌株1-fliShb,并对所得菌株的生物学特性和鞭毛进行观察,结果表明,与野生菌株相比,鞭毛蛋白基因缺失突变菌株的游动性、菌膜形成能力减弱,互补后游动性、菌膜形成能力基本恢复;缺失突变菌株对甜瓜、西瓜幼苗以及西瓜果实的致病性降低,互补后对西瓜、甜瓜幼苗及西瓜果实的致病力完全恢复.电镜测试显示,突变菌株鞭毛变短,长度约为野生菌株的1/3-1/4,互补后鞭毛合成能力基本恢复,鞭毛长度约为野生菌的4/5;光学显微镜下,可观察到在NA平板上的野生菌株菌落周围有明显的由细菌颤泳形成的特殊晕圈,而缺失突变菌株在NA平板上不能形成这种晕圈,互补后晕圈形成能力部分恢复;缺失突变菌株的生长速率比野生菌株慢,互补后生长速率没有恢复;野生菌株、突变菌株和互补菌株在过敏性反应和群体感应方面无差异.qRT-PCR分析结果显示,fliS基因缺失突变后,flhD表达量较野生菌株明显降低,f1iE、f1iC和flgK表达量较野生菌株明显升高,flgM和f1iD表达量略微上升,f1iA表达量基本不变;互补菌株中f1hD、fliE和fliC表达量部分恢复,flgK、flgM和f1iD表达量没有恢复,与突变菌株相同.[结论]鞭毛基因f1iS对果斑病菌鞭毛丝的形成、游动性、菌膜形成能力、生长速率、菌落形态、致病性等均有调控作用.

关键词：西瓜果斑病菌(西瓜噬酸菌)、细菌性果斑病、fliS、生物学特性

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分类号：S43;TQ9

资助基金：国家公益性行业农业科研专项201003066-2;福建省自然科学基金2014J01084;福建农林大学发展基金KF2015058;福建农林大学科技创新专项基金CXZX2016133

在线出版日期：2017-11-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：2946-2956