番茄抗性相关基因SlHin1的克隆、表达与抗病毒功能

摘要：

[目的]克隆番茄抗性相关基因SlHin1 (harpin-induced gene 1),分析其生物信息学特征、组织表达和亚细胞定位情况,研究其在抗烟草花叶病毒侵染、移动中的作用,为番茄抗性育种提供理论依据.[方法]通过RT-PCR及基因克隆方法,从番茄总RNA中克隆得到基因SlHin1;应用生物信息学方法分析其DNA序列及其编码的蛋白序列特性,使用MEGA6.0对SlHIN1氨基酸序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;将该基因片段通过Sa1 I和Bam HI双酶切连接至荧光表达载体pCV-mGFP-C1,采用GFP标记的方法进行亚细胞定位检测,分析编码蛋白表达位置;利用实时荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)分析该基因在番茄不同组织的表达量水平;将该基因片段通过Nco I和Bam HI通过双酶切连接至植物表达载体pFGC5941,用土壤农杆菌EHA105瞬时过表达该基因并接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,以检测植株对病毒的抗性变化,间接ELISA法检测病毒的含量,探究该基因的抗病毒功能.Western blot验证SlHIN1蛋白在本氏烟内的表达情况.[结果]利用RT-PCR方法从番茄材料(Solanum lycopersicon cv.Ailsa Craig)的叶片组织中克隆得到全长为675 bp的番茄抗性相关基因SlHin1,将序列分别提交至GenBank,得到序列号KU195820.序列比对及生物信息学分析表明,其基因预测编码225个氨基酸,分子量为26.1 kD,理论等电点为9.35,结构上具有LEA-14保守结构域,不具有跨膜区段,并且位于番茄基因组1 0号染色体上(Solyc10g081980);多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与茄科植物HIN1氨基酸同源性80.0％以上而与水稻、高粱单子叶植物的亲缘关系较远;亚细胞定位显示定位在细胞膜上与PSORT Prediction预测的亚细胞定位最高概率一致;qRT-PCR结果分析表明该基因具有组织特异性,表达量在根、叶、茎间依次降低;在本氏烟中瞬时过表达SlHIN1并在表达部位接种标记有绿色荧光的烟草花叶病毒侵染性克隆,处理组本氏烟在接种病毒4d后没有任何荧光出现,而对照组出现绿色荧光.随着接种时间推移,接种7d后处理组叶片上零星荧光有略微的扩大,而对照组的绿色荧光已经扩散至心叶.间接ELISA检测病毒含量较对照组少,处理组的病毒扩散受到抑制.Western blot分析结果表明,显色后的硝酸纤维素膜上约在26 kD处有一特异条带,而空载体的对照无相应条带,说明SlHIN1蛋白在注射部位成功表达.[结论]Hin1在供试科植物中均存在,其中SlHin1定位在细胞膜,过表达该基因可抑制病毒扩散,推测其可能参与茄科植物对烟草花叶病毒的抗性反应,使植株获得抗性.

关键词：番茄、SlHin1、烟草花叶病毒、表达、抗病毒

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分类号：S43;S64

资助基金：国家自然科学基金31670148;重庆市社会事业与民生保障创新专项cstc2015shms-ztzx80012;中央高校基本科研业务费专项资金XDJK2016A009,2362015xk04

在线出版日期：2017-06-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：1242-1251