柑橘衰退病毒基因p23RNAi载体的构建及转化

摘要：

[目的]构建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi载体,以获得具有抗性的柑橘转基因植株.[方法]基于转化病毒基因介导抗性,根据NCBI公布的CTV基因组序列,查找p23保守序列,设计并克隆两条不同长度的片段.对两条片段和植物表达载体pBI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体.初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性.利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片,利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况.发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型,利用酶联免疫反应(ELISA)检测病毒含量.同时,提取叶片的RNA并反转录为cDNA,利用实时荧光定量PCR (q-PCR)检测CTV p20,通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量.通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段,抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗.提取大红甜橙叶片的DNA,通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性;目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗;根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物,检测转基因植株中p23的表达情况.取CTV T36基因型寄主的带皮芽,用腹接法接种大红甜橙转基因植株.取接种后新萌发枝梢上的叶片,用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性.对于第1次接种后未检测出病毒感染的植株,进行第2次接种并检测分析.[结果]克隆得到CTV p23 513 bp的长片段和291 bp的短片段,与载体pBI121连接后成功构建含发夹结构的来自病原且能靶向目的基因的RNAi载体,命名为p23-RNAi.注射p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片经GUS染色后能够产生蓝色斑点,表明农杆菌p23-RNAi可以在叶片中发生瞬时表达;接种CTV后第1 5和30天,瞬时表达p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片ELISA检测结果均为阴性,同时q-PCR检测结果显示其CTV p20的积累水平和增加速度明显低于对照植株,表明瞬时表达的p23-RNAi在一定时间内可以对CTV的侵染产生抑制.p23-RNAi经农杆菌介导遗传转化大红甜橙获得抗性芽,通过普通PCR的扩增结果证明得到7个转基因植株;q-PCR检测结果进一步表明7个转基因植株间p23的含量呈现一定差异,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G.接种CTV后,p20的表达量在7个转基因植株间也表现出一定差异,表达量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且与对照植株相比,呈现不同程度的抗病性.转基因植株对病毒的抗性与外源基因的表达水平没有相关性,外源基因表达水平最高的植株E并没有表现强的CTV抗性.经过两次病毒接种,转基因植株C在接种后具有完全抗性.[结论]p23-RNAi载体能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬时表达技术可快速鉴定RNAi载体的抗病性,有利于筛选高效率的RNAi载体.

关键词：柑橘衰退病毒、p23、RNAi、大红甜橙、瞬时表达、遗传转化

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资助基金：国家自然科学基金30900972,3157211、国家公益性行业农业科研专项201203076-06、湖南省研究生科研创新项目CX2013B290

在线出版日期：2017-01-07（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：3927-3933