西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB转录因子的克隆及表达分析

摘要：

【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因 ClMYB转录因子，进行生物信息学及表达模式分析，为进一步解析ClMYB在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和Microarray数据分析，获得与西瓜抗枯萎病相关的基因ClMYB，采用RT-PCR技术分离克隆ClMYBcDNA全长序列；应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征；使用MEGA5.0对ClMYB蛋白序列及其同源序列进行多序列比对，并构建同源物种间系统进化树；采用GFP标记的方法进行亚细胞定位，分析编码蛋白表达位置；将该基因片段通过Nde I和Xba I双酶切连接至原核表达载体pCzn1，重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express，经终浓度为0.5 mmol·L-1IPTG诱导4 h，用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达；利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在西瓜与枯萎病菌互作中及在茉莉酸（jasmonate，JA）诱导下的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从西瓜野生材料PI296341-FR根系组织中克隆该基因片段（GenBank：KT751229），序列比对及生物信息学分析表明，其基因编码的氨基酸序列具有MYB转录因子R2R3型的典型特征，其N端具有R2、R3两个MYB结构域，C端高度变异。多序列比对及进化树分析表明，该基因编码的蛋白与甜瓜MYB（GenBank：XM_008440304）和黄瓜MYB（GenBank：XM_011652633）同源性最高，其编码的氨基酸一致性达到86%，这与它们同属葫芦科植物有关；亚细胞定位显示ClMYB定位于细胞核，为典型的转录因子；成功构建了该基因的原核表达载体pCzn1-ClMYB，转化至大肠杆菌得到36 kD左右蛋白；ClMYB受枯萎病菌诱导，在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中，相对感病品种表达量高峰出现的早，且表达量高。50μmol·L-1的MeJA处理可以显著提高感病材料Black diamond对枯萎病的抗病水平，同时诱导ClMYB表达，与抗病材料PI296341-FR相比表达趋势一致，但表达量更高。【结论】ClMYB为典型的R2R3-MYB转录因子，亚细胞定位于细胞核中；基因的原核表达得到36 kD的融合蛋白，在西瓜中的表达受枯萎病菌和茉莉酸诱导，推测ClMYB可能参与JA介导的西瓜抗枯萎病防卫反应的信号通路，在西瓜抗病中起一定的作用。

关键词：西瓜、枯萎病、ClMYB转录因子、基因克隆、表达分析

所属期刊栏目：49

分类号：S65;S6

资助基金：国家自然科学基金31201632;河北省自然科学基金C2016204138

在线出版日期：2016-11-03（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：3358-3368