Bt Cry1类毒素共性结构域的分析、表达及鉴定

摘要：

[目的]分析定位Bt Cry1类毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性结构域,克隆并表达共性结构域蛋白,为筛选Bt毒素广谱抗体及建立广谱检测方法打下基础.[方法]利用生物信息学和分子模拟技术,通过SWISS-M0DEL同源建模分别对5种Cry1类毒素进行三维建模,并结合Ramachandran p1ot、ERRAT和Verify3D方法评价模型构象的合理性.通过分析比对5种Cry1类毒素的三维结构,确定Domain Ⅰ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域.以含Cry1Ac基因的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种为模板设计引物,PCR扩增获得共性结构域Domain Ⅰ基因,将其经Nco Ⅰ和Not Ⅰ双酶切连接至原核表达载体pET-26b(+),构建原核表达载体pET-26b-Domain Ⅰ.重组质粒经菌液PCR、双酶切以及测序鉴定验证正确后,转化至E coli BL21(DE3),经终浓度为1 mmol·L-1的IPTG在20℃下诱导表达16h后检测共性结构域蛋白的表达情况.离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达.利用His-Trap HP镍亲和柱纯化上清中的可溶性融合蛋白,经SDS-PAGE电泳、Western blot和ELISA试验验证纯化的共性结构域蛋白的生物活性.[结果]基于氨基酸序列及三维空间比对分析,发现5种Cry1类毒素的Domain Ⅰ的序列一致性最高,而且它们的Domain Ⅰ三维结构几乎完全重合,确定Domain Ⅰ区域作为5种Cry1毒素的共性结构域;通过PCR、双酶切及测序鉴定成功构建原核表达载体pET-26b-Domain Ⅰ,经IPTG诱导表达、His-Trap HP镍亲和柱纯化获得了可溶性的Domain Ⅰ共性结构域蛋白;SDS-PAGE和Western blot证实表达的共性结构域蛋白的分子量约为33.4 kD,且能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应;ELISA试验证实共性结构域蛋白与5种Cry1类毒素特异性抗体均具有很强的结合能力,抗原表位分析结果显示共性结构域蛋白具有和完整的Cry蛋白存在多个潜在抗原表位位点的特征,抗原表位区域所占的比例分别为48.4％和63.6％,表明共性结构域蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性.[结论]基于分子模拟与分子克隆技术,成功定位及表达纯化获得共性结构域蛋白,为下一步利用共性结构域为靶标分子制备广谱特异性识别Cry1类毒素抗体打下基础.

关键词：Bt Cry1类毒素、共性结构域、原核表达、纯化

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资助基金：国家自然科学基金31371778、31301703、国家公益性行业农业科研专项201303088、江苏省自主创新项目CX145068

在线出版日期：2016-10-21（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：3130-3139