西瓜花叶病毒(WMV)单克隆抗体的制备及其应用

摘要：

[目的]制备抗西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)的特异性单克隆抗体,并以其为核心建立能快速有效地检测WMV的血清学方法,从而为中国田间西瓜花叶病毒病的诊断和检测、预测预警及科学防控体系的建立提供物质和技术支撑.[方法]用提纯的WMV病毒粒子免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和细胞培养、抗体筛选和细胞克隆等杂交瘤细胞技术,获得能稳定分泌抗WMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔制备其单抗腹水,并以制备的单抗为核心建立能准确、特异、灵敏地检测田间植物中WMV的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR方法,以及能检测单头传毒介体蚜虫体内WMV的dot-ELISA方法.[结果]3株能稳定分泌WMV单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8、15A8和16C12)及其单抗腹水被制备,3株杂交瘤细胞分泌的单抗腹水的间接ELISA效价均达到了10-6以上,抗体类型及亚类均为IgGl、kappa轻链.Western blot分析发现,这3个单抗均与WMV的外壳蛋白亚基有特异性反应.灵敏度分析结果表明,ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA和IC-RT-PCR方法检测WMV病叶的灵敏度分别达到1:163 840、1:327 680、1:5 120和1:1 310 720倍稀释(w/v,g/mL).特异性分析结果表明,以这3个单抗为核心建立的ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA和IC-RT-PCR 5种血清学检测方法均能与感染WMV的病叶发生特异性免疫反应,而与感染小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)、马铃薯Y病毒(Pota tovirus Y,PVY)的植物样品、健康白南瓜、西瓜、葫芦和烟草的植物组织均呈阴性反应,且dot-ELISA方法还能特异性地检测单头蚜虫体内的WMV,而在检测无毒蚜虫时呈阴性反应.利用建立的血清学检测方法对采自浙江省、江苏省、山东省和海南省的275株葫芦科疑似病株进行检测,结果发现1 87株植物感染WMV,发病率达68％,说明WMV在中国田间葫芦科植物中广泛流行发生,且血清学方法的检测结果与RT-PCR方法的检测结果完全一致,将部分PCR产物进行核酸测序和序列比对分析,结果表明这些PCR产物是WMV CP基因片段,证明血清学方法检测阳性的样品确实感染WMV.[结论]获得了3株特异、灵敏的WMV单克隆抗体,以其为核心建立的5种血清学方法能准确、灵敏、可靠地应用于田间样品中WMV的检测,从而为中国WMV田间样品的大规模快速检测和诊断、该病害预报预警和科学防控提供物质和技术支撑.

关键词：西瓜花叶病毒(WMV)、单克隆抗体、ACP-ELISA、DAS-ELISA、dot-ELISA、Tissue blot-ELISA、IC-RT-PCR

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资助基金：国家自然科学基金31272015、国家公益性行业农业科研专项201203076-05

在线出版日期：2016-10-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：2711-2724