家蚕 bHLH 转录因子 Bmdimm 与 Bmchip 的相互作用

摘要：

【目的】bHLH 转录因子 Bmdimm 是家蚕（Bombyx mori）5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现 Bmdimm 蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基 K43，因此推测 Bmdimm 可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip 属于家蚕泛素连接酶 E3家族中的 U-box 亚家族，在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确 Bmdimm 与 Bmchip 之间的相互作用，以便于更好地理解 Bmdimm 在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析 Bmdimm 和 Bmchip 在后部丝腺中的表达情况；分别通过 PCR 和基因合成获得 Bmdimm 和 Bmchip 的 CDS 序列，将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白，筛选最优的表达条件；利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白，加入蛋白酶酶切，并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签，纯化 Bmdimm 和 Bmchip 蛋白；利用凝胶过滤层析分析 Bmdimm 和 Bmchip 在溶液中的聚集状态；利用圆二色光谱研究 Bmdimm 和 Bmchip 蛋白的二级结构；利用 Far-western blotting 和 Pull-down 研究 Bmdimm 和 Bmchip 在体外的相互作用；利用微量热泳动研究 Bmdimm 和 Bmchip 结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示 Bmdimm 和 Bmchip 在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了 Bmdimm 和 Bmchip 多种表达载体，发现ppSUMO-Bmdimm 和 pET-32M·3C-Bmchip 表达载体在16℃，0.3 mmol·L-1 IPTG 诱导下表达最好，并以此为基础表达纯化了 Bmdimm 和 Bmchip 蛋白；凝胶过滤分析表明 Bmdimm 和 Bmchip 蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在；圆二色光谱显示 Bmdimm 和 Bmchip 蛋白都含有α-螺旋结构； Far-western blotting 和 Pull-down 结果表明 Bmdimm和 Bmchip 可以在体外结合；利用微量热泳动实验计算出 Bmdimm 和 Bmchip 结合的平衡解离常数为(750±28.6)μmol·L-1。【结论】家蚕 bHLH 转录因子 Bmdimm 和泛素连接酶 Bmchip 在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达，二者可以在体外发生瞬时相互作用，暗示了 Bmdimm 可能通过 Bmchip 介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。

关键词：家蚕、Bmdimm、Bmchip、相互作用、泛素化

所属期刊栏目：49

分类号：R735.2;S963.7;R392.1

资助基金：国家重点基础研究发展计划（973计划）;国家自然科学基金;重庆市基础与前沿研究计划;中央高校基本科研业务费专项;博士基金

在线出版日期：2016-08-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：2027-2038