葡萄A病毒RT-LAMP检测方法的建立

摘要：

[目的]葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)是葡萄皱木复合病的重要病原之一,以带毒种苗的嫁接为田间主要传播途径.使用无毒葡萄苗木进行生产是控制该病毒病害的根本措施,而简便灵敏的检测技术是筛选无毒种苗的有效保证.为此,开展针对GVA的反转录环介导等温扩增技术(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)研究,旨在建立其RT-LAMP特异性检测方法.[方法]通过比对分析GVA的CP(coat protein)基因序列并经引物设计软件Primer Explore 4.0设计,获得6条检测引物GVA-FIP (5'-CTTACAGCCACGCTCAGAGTCC-CGTGGGAAGTTGGTTGTGT-Y)、GVA-BIP (5'-GCCCGTCAAAGGGGCTACAC-TCATAGGCGTTCTGTGCGA-3')、GVA-F3(5'-AGAAGATGGGGATAGACCCG-3')、GVA-B3 (5'-CCGCCATTAACACGAGGAA-3')、GVA-LF (5'-ATCCTTCCCACCAGCTCGG-3')和GVA-LB(5'-TCAGGCAGATGTGTGAACCT-3').将RT-LAMP的反应温度分别设为59、61、63和65℃,根据1h扩增曲线出现的先后次序确定最佳反应温度.以同样侵染葡萄的沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting-associa ted virus,GRSPaV)、葡萄卷叶病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaV)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)的阳性材料及阴性对照(健康葡萄叶片,用NC表示)的总RNA为模板,对RT-LAMP方法的特异性进行测定.将GVA的总RNA进行10倍梯度稀释,得到101、1 02、103、104、105、106倍的不同稀释液后用作模板分别进行RT-LAMP和普通RT-PCR检测,比较两者的灵敏度.RT-LAMP产物可进行实时扩增曲线检测,阳性样品在浊度仪上出现扩增曲线,阴性样品无扩增曲线;还可进行染料颜色反应检测,在反应产物中加入SYBR Green Ⅰ染料,阳性样品产生肉眼可见的绿色,阴性反应为橙色.[结果]建立了GVA的RT-LAMP快速特异性检测方法,最佳反应温度为65℃.该方法约27 min即可检测到扩增曲线,而普通RT-PCR获得检测结果约需1.5h.特异性试验表明只有GVA的总RNA能够出现扩增曲线,反应液颜色变为绿色,显示为阳性,而其他3种参试病毒和健康对照没有出现扩增曲线,反应液的颜色为橙色,显示为阴性;RT-LAMP检测结果可通过肉眼观察直接判断,比普通RT-PCR结果判断容易.灵敏度试验显示RT-LAMP可检测到101、102、10 3、104和105倍的GVA总RNA稀释液模板,而普通RT-PCR只能检测到101、102、103和104倍的GVA总RNA稀释液模板,表明前者比后者的灵敏度高1 0倍.[结论]研究建立的RT-LAMP方法能够快速特异地检测GVA,可为筛选无GVA葡萄苗木提供技术支持;适用于检疫、科研及生产机构在进境检疫、苗木繁育和大田监测工作中对GVA的检测鉴定.

关键词：葡萄A病毒、反转录环介导等温扩增技术、检测

所属期刊栏目：49

分类号：S852.65;S663.1;S436.631.12

资助基金：公益性行业科研专项;新疆维吾尔自治区科技支疆项目

在线出版日期：2016-06-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：103-109