HOPX基因过表达对鸡前脂肪细胞增殖的影响

摘要：

【目的】构建鸡HOPX基因（homeodomain only protein X）全长编码区（coding region sequence, CDS）的真核表达载体，转染鸡原代前脂肪细胞，探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】利用Primer Premier 5.0软件设计鸡HOPX基因CDS区上、下游引物，以AA肉鸡腹部脂肪组织的cDNA为模板，采用PCR扩增、克隆鸡HOPX基因全长CDS区，并将其亚克隆至真核表达载体（pCMV-HA vector），获得HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及Western blotting方法分析鉴定pCMV-HA-HOPX。采用胶原酶法分离培养12日龄AA商品肉仔鸡腹部脂肪组织原代前脂肪细胞，瞬时转染pCMV-HA-HOPX，转染6 h时后消化细胞，按照每孔50000个细胞数接种12孔培养板，并在细胞贴壁0、24、48和72 h，分别采用显微镜观察和CCK-8细胞增殖检测试剂盒分析HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响；同时，利用TRIzol法提取组织和细胞总RNA，并反转录合成cDNA，采用Real-time RT-PCR方法分析细胞增殖标志基因CyclinD1和PCNA的mRNA表达。【结果】测序结果显示，鸡HOPX基因的全长CDS区大小为222 bp，与NCBI发布的鸡HOPX基因mRNA序列（NM_204556）一致；利用HA标签抗体的Western blotting分析显示，真核表达载体pCMV-HA-HOPX能够表达出预期大小的蛋白分子（约9.5kD），表明鸡HOPX基因的真核表达载体pCMV-HA-HOPX构建成功。显微镜观察发现，转染pCMV-HA-HOPX载体的细胞（HOPX过表达组）在细胞贴壁后培养24和48 h的细胞数量低于转染pCMV-HA vector空载体（空载体对照组）的细胞数量；CCK-8检测分析发现，转染pCMV-HA-HOPX载体细胞的吸光度值（OD值）在细胞贴壁后培养24、48和72 h都极显著低于空载体对照组（P＜0.01）。与细胞增殖检测结果相一致，细胞增殖标志基因表达检测分析发现，在细胞贴壁后培养24 h后，HOPX过表达组细胞Cyclin D1基因的mRNA表达量显著低于空载体对照组（P＜0.05）；在细胞贴壁后培养48 h时，HOPX过表达组的PCNA基因的mRNA表达量显著低于空载体对照组（P＜0.05）；在细胞贴壁后培养72 h时，HOPX过表达组的PCNA和Cyclin D1基因的表达量均极显著低于空载体对照组（P＜0.01）。【结论】HOPX基因过表达在体外抑制鸡原代前脂肪细胞的增殖。

关键词：鸡、HOPX、前脂肪细胞、增殖

资助基金：国家“973”计划2009CB941604;国家肉鸡产业技术体系项目CARS-42;黑龙江高校科技创新团队建设项目2010td02

在线出版日期：2015-05-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1624-1631