聚肌胞浓度和免疫刺激时间对猪外周血单核细胞基因表达的影响

摘要：

【目的】聚肌胞（Poly I：C）是聚肌苷酸和聚胞苷酸的共聚物，能够模拟病毒感染后所形成的dsRNA，刺激机体产生抗病毒免疫反应和炎症反应。利用Poly I：C作为免疫刺激剂对猪外周血单核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的免疫刺激试验中Poly I：C的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间的研究还未见报道。本研究探讨不同的Poly I：C免疫剂量和免疫刺激时间对猪PBMC各细胞因子和受体基因表达的影响，确定Poly I：C进行免疫试验的最佳作用浓度和体外免疫刺激培养时间，为利用Poly I：C进行RNA病毒感染的免疫应答调控机理研究提供试验依据。【方法】以长白仔猪为研究对象，利用分离的PBMC和1﹕5稀释的EDTA-抗凝血，设置Poly I：C浓度梯度（0、10、20和40μg·mL-1）和不同的体外免疫刺激培养时间（4、8、12和24 h），通过荧光定量PCR方法测定Poly I：C免疫刺激下机体激活或者诱导表达的主要细胞因子（IL6，IL8，TNFα，IL10，IRF3，IFNα和IFNγ）和模式识别受体（TLR3和TLR4）的相对表达量，分析利用Poly I：C对猪全血和PBMC进行免疫刺激试验的最佳作用浓度和时间。【结果】猪PBMC中细胞因子和受体基因的表达量受Poly I：C浓度和免疫刺激时间的影响。各基因具有特征性的表达量变化曲线，达到最高表达变化倍数的浓度和体外培养时间各不相同。对于两个干扰素基因 IFNα和 IFNγ，最高表达量出现在 Poly I：C免疫刺激培养4 h，而后随着培养时间的延长表达量逐渐降低，而其他5个细胞因子（IL6，IL8，TNFα， IL10和IRF3）和2个模式识别受体（TLR3和TLR4）基因随着Poly I：C浓度的增加和免疫刺激时间的延长变化倍数逐渐增加，在Poly I：C浓度为20-40μg·mL-1，免疫刺激时间为12-24 h达到最高表达量。但是，对于最高表达量出现在浓度20μg·mL-1和培养时间12 h的基因，其在浓度为40μg·mL-1和培养时间24 h表达变化量只有小幅下降。另外本研究还对比检测了1﹕5稀释血在Poly I：C免疫刺激下主要细胞因子和受体的表达变化，结果表明全血中各细胞因子和受体的整体表达变化倍数比PBMC低很多，特别是对于IL6和IL8这两个 PBMC 中表达变化很大的基因，全血中表达变化量不仅很小，而且变化趋势相反。相对于 PBMC，稀释全血完整地保存了机体的原始状态，但是利用全血进行免疫试验的主要缺点是抗凝剂保留在全血中。研究中EDTAK2抗凝剂能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，但是钙离子是细胞的重要信号分子，钙离子与EDTA的结合对后续的细胞功能可能产生一定的影响。另外，全血中的某些化合物与血浆蛋白的等成分可能参与免疫细胞对Poly I：C免疫刺激的调节，减少了对Poly I：C免疫刺激的应答。【结论】（1）综合分析所检测的细胞因子和受体的变化趋势，利用Poly I：C进行猪PBMC免疫刺激试验的最佳浓度和体外培养时间分别为20μg·mL-1和24 h。（2）1﹕5稀释的EDTA-抗凝血对Poly I：C免疫反应反应小，与PBMC对Poly I：C免疫应答有不同的应答反应趋势。

关键词：猪、聚肌胞(Poly I:C)、外周血单核细胞(PBMC)、基因表达

分类号：S852.4+2;R73-37;R392.2

资助基金：国家自然科学基金;山东省优秀中青年科学家科研奖励基金;山东省农业产业技术体系建设项目生猪创新团队项目;山东省农业良种工程农业生物资源创新利用研究项目

在线出版日期：2015-03-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：584-594