10.3864/j.issn.0578-1752.2015.02.17
小峰熊蜂可溶型海藻糖酶基因的克隆及表达分析
【目的】克隆小峰熊蜂（Bombus hypocrita）可溶型海藻糖酶基因（soluble trehalase，Tre-1）全长 cDNA 序列，预测该基因及其编码蛋白的理化性质，明确该基因在小峰熊蜂不同组织及不同发育时期的表达特性，为研究该基因在小峰熊蜂生长发育中的生物学功能奠定基础。【方法】根据地熊蜂（B. terrestris）和 B. impatiens可溶型海藻糖酶基因 Tre-1编码蛋白的保守区序列，利用 Primer Premier 5.0设计简并引物扩增得到小峰熊蜂保守区片段；随后根据该片段设计基因特异性引物，用 RACE 方法获得5'端和3'端片段。在此基础上，根据 RACE 扩增所得片段和保守序列，预测开放阅读框（ORF）序列，分别在起始密码子近5'端和终止密码子的近3'端设计 ORF区特异性引物扩增得到 ORF，最后采用 BioEdit 软件比对、拼接获得小峰熊蜂 Tre-1 cDNA 全长序列。运用 ExPASy、SignalP 4.1、NetOGlyc 1.0 sever、ClustalW 和 MEGA 5.0等软件对该基因进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量 PCR 技术，采用2-ΔΔCt方法检测不同组织及不同发育时期可溶型海藻糖酶基因的相对表达量。【结果】克隆所得基因 cDNA 全长为3129 bp，命名为 BhTre-1（GenBank 登录号：KJ025078），其中包含5'端441 bp 非编码区和3'端945 bp 非编码区，ORF 为1743 bp，共编码580个氨基酸。其编码的蛋白预测分子质量为67.16 kD，等电点为5.95；有1个信号肽结构（1—21位），1个甘氨酸富集区（GGGGEY），2个特色“标签序列”（PGGRFKEFYYWDSY和 QWDFPNAWPP），6个 Asn-Xaa-Ser/Thr（N-X-S/T）序列，无跨膜区。序列分析发现 BhTre-1氨基酸序列与地熊蜂 BtTre-1和 B. impatiens BiTre-1的一致性很高，分别为99%和98%，与西方蜜蜂（Apis mellifera）和云南小蜜蜂（A. florea）的 Tre-1一致性也达到78%；系统发育分析也表明 BhTre-1与 BtTre-1、BiTre-1的亲缘关系最近，与 AmTre-1、AfTre-1之间的亲缘关系次之。基因定量分析结果显示 BhTre-1在成虫被检测的各组织中均有表达，在中肠的表达量最高，其次是马氏管，其他各组织表达量较低。成年工蜂的 BhTre-1表达量高于幼虫和蛹，工蜂出房后随着龄期的增加表达量呈现先升高后降低的规律，在第15天表达量最高。【结论】克隆得到了BhTre-1全长 cDNA 序列，其分子生物学特性与其他昆虫 Tre-1相似，该基因在小峰熊蜂中肠表达量最高，此外，幼虫和蛹的表达量低于成年工蜂，工蜂出房后表达量呈现先升高后降低的趋势，为进一步研究该基因在小峰熊蜂体内的生物学功能奠定了基础。
小峰熊蜂、可溶型海藻糖酶基因、克隆、序列分析、基因表达
Q78;R329.28;Q5
国家自然科学基金;国家蜂产业技术体系项目
2015-02-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共11页
370-380
