大足黑山羊 PHLDA2基因的克隆、组织表达与印记状况分析

摘要：

【目的】克隆大足黑山羊 PHLDA2（pleckstrin homology-like domain, family A, member 2）基因序列，分析其组织表达特征、印记状况以及与胎盘性状的关系，为深入研究该基因在山羊胎盘中的功能积累数据。【方法】根据人、牛和猪 PHLDA2的保守区域设计引物以 RT-PCR 方法扩增大足黑山羊该基因部分 cDNA 序列，进一步利用5′-和3′-RACE 技术获得全长 cDNA 序列；利用 ORF Finder 和 ProtParam 等在线工具分析 PHLDA2基因序列特征；采用 Real-time PCR 方法分析 PHLDA2在大足黑山羊心、肝、脾、肺、肾、大脑、肌肉、脂肪、舌和胎盘等10个组织的表达差异；寻找大足黑山羊和波尔山羊 PHLDA2基因序列 SNP 位点，基于表达 SNP 的方法分析该基因在 F1代组织中的印记状况；采用线性回归的方法分析 PHLDA2表达量与胎盘性状的关系。【结果】克隆得到935 bp 大足黑山羊 PHLDA2的 cDNA 全长序列,其中5′-UTR、3′-UTR 和编码序列分别为62 bp、450 bp 和420 bp，其编码140个氨基酸。预测的山羊 PHLDA2蛋白分子量大小为15638.7 Da，等电点为9.18，二级结构由α-螺旋(37.14%)、β-转角(9.29%)、延伸链(23.57%)和无规卷曲(30%)组成,并且包含保守的 PH（pleckstrin homology）结构域。③BLAST 分析发现，山羊 PHLDA2定位于29号染色体，其与牛、猪、猕猴、马和人同源基因核苷酸序列的相似性分别达到91%，90%，90%,90%和89%，在核苷酸和氨基酸序列上与牛的亲缘关系最近。④荧光定量 PCR 结果显示PHLDA2在山羊胎盘中表达量最高（P <0.01)，在心、肝、肺、肾、肌肉、脂肪、舌和大脑组织中表达量很低且差异不显著（P >0.05),在脾中未检测到表达。⑤印记分析表明，PHLDA2在初生山羊胎盘、心脏和肝脏组织表达母源等位基因，但在肺、大脑和肌肉组织为双等位基因表达。⑥PHLDA2表达水平与山羊胎盘重回归关系显著（n=15，R2=0.855，P <0.01）。【结论】山羊 PHLDA2基因序列和结构特征具有物种间的保守性，但是其印记状况具有组织特异性； PHLDA2为山羊胎盘的生长和功能调控的重要基因。

关键词：山羊、PHLDA2、基因克隆、荧光定量PCR、组织表达、印记分析

分类号：TS207.4;S881.2;R181.3

资助基金：重庆市科委自然科学研究项目;中央高校基本科研业务费专项

在线出版日期：2015-02-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：343-351