SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测小麦纹枯病菌体系的建立和应用

摘要：

【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一，早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂，而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测，研究旨在建立小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR（real-time PCR）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin 序列，设计1对特异性引物，建立并优化 SYBR Green I real-time PCR 反应体系，利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（R. solani）、双核丝核菌 AG-A 和 AG-F 菌株、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）和禾谷镰孢（F. graminearum）等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝 DNA 进行普通 PCR 和 real-time PCR 特异性检测，并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d 不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强，普通 PCR 检测结果仅小麦纹枯病菌 DNA 有扩增条带。Real-time 检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰，对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通 PCR 检测的灵敏度为6.5×103 copies/μL, real-time PCR 的灵敏度可达到6.5×102 copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品，构建的 real-time PCR 标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，熔解曲线的吸收峰单一，相关系数为0.997，扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行 real-time PCR 检测，结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于 real-time PCR 技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测、指导病害预测和防治。

关键词：小麦纹枯病菌、SYBR Green I、实时荧光定量 PCR、早期检测

分类号：S43;TQ4

资助基金：国家“十二五”粮食丰产科技工程2012BAD04B07;中国科学院知识创新工程重大项目KSCX2-EW-N-08

在线出版日期：2015-02-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：55-62