紫花苜蓿盐诱导类受体蛋白激酶基因MsSIK1的克隆及功能分析

摘要：

【目的】对紫花苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhongmu-1）stress-induced protein kinase gene 1（MsSIK1）进行克隆与表达研究，了解该基因的分子机制及其应用。【方法】以紫花苜蓿叶片总RNA为模板，根据同源克隆设计简并引物，利用RT-PCR结合RACE技术，获得MsSIK1的编码序列。利用同源性比对进行序列分析。通过SMART网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）模拟该基因的蛋白结构。构建MsSIK1的亚细胞定位瞬时表达载体，使用基因枪转化法将MsSIK1与GFP在洋葱表皮细胞中融合瞬时表达并观察其亚细胞定位荧光信号。通过Real time-PCR分析MsSIK1在NaCl、ABA和干旱处理条件下的表达特征。利用农杆菌侵染方法获得转基因拟南芥植株，通过RT-PCR对转基因植株进行表达鉴定，获得转基因植株后，利用转基因株系进行盐处理进而对成苗期转基因拟南芥性状鉴定。在盐胁迫处理下，测定野生型与转基因株系的叶绿素含量、MDA含量进而验证该基因的抗盐功能。【结果】获得MsSIK1编码序列2478 bp，编码825个氨基酸。该蛋白C端与多种植物激酶具有相当高的同源性，模拟蛋白结构发现该基因具有类受体蛋白激酶高度保守的丝氨酸/苏氨酸结构域、跨膜结构域和富含亮氨酸重复序列的膜外结构域。Real time-PCR分析表明该基因在NaCl、ABA和干旱处理条件下上调表达，其中在盐处理条件下， MsSIK1表达先升高后降低，在处理4 h时达到最大值（约为对照值的7倍）。在干旱胁迫处理时，MsSIK1受诱导表达增强明显，当处理2 h时表达量达到最大值（约为对照值的6倍）；ABA处理时，MsSIK1被诱导表达明显，当处理3 h时表达量达到最大值，约为对照值的6.8倍。MsSIK1与GFP融合瞬时表达的洋葱表皮细胞中的荧光信号主要集中于质膜附近，转化空载体的洋葱表皮细胞中的荧光信号分布于细胞各个部位。转基因植株的RT-PCR鉴定表明，T 1代6个株系中所得到的MsSIK1条带明显、亮度高，且T 1-10中表达量最高；但在野生型中检测不到该条带，说明外源基因已经整合到拟南芥染色体中并能遗传到子代。成苗期转基因拟南芥盐处理后发现T3-2、T3-6、T3-10转基因株系较野生型植株长势好，说明MsSIK1的转入提高了拟南芥的抗盐性。与对照相比，转MsSIK1拟南芥在NaCl处理下，叶绿素含量下降较少，其中，野生型叶绿素含量降低了77%，T3-3降低了53%，T3-6降低了44%，T3-10降低了35%；同样盐胁迫下，3个转基因株系的MDA含量积累较少，其中，野生型MDA的含量是T 3-10株系的1.3倍。【结论】MsSIK1作为一个类受体蛋白激酶受多种逆境胁迫诱导，该基因的过量表达提高了拟南芥的抗盐性。

关键词：紫花苜蓿、MsSIK1、类受体蛋白激酶、盐胁迫、功能研究

分类号：S512.1;Q943.2;Q78

资助基金：国家自然科学基金;辽宁省科技计划;新疆维吾尔自治区科技支疆项目;辽宁省高等学校学校优秀人才支持计划

在线出版日期：2015-01-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：4543-4551