豌豆蚜温度受体基因Painless的克隆及时间和组织表达

摘要：

【目的】从豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）触角中克隆候选的温度受体基因--Painless，分析该基因所编码的蛋白结构特点，研究该基因在昆虫不同发育时期和不同组织中的表达谱，探讨该基因的功能。【方法】通过生物信息学的方法，使用果蝇（Drosophila melanogaster）Painless从豌豆蚜基因组数据库 AphidBase 中预测ApisPainless的假定全长序列，之后根据预测得到的假定全长序列，使用Primer premier 5.0设计全长引物，使用RT-PCR方法从豌豆蚜触角cDNA中克隆ApisPainless的全长序列，并应用DNAMAN软件对预测序列与克隆序列进行比对，确定克隆序列与预测序列一致后，使用在线工具SMART（simple modular architecture research tool）对克隆得到的ApisPainless蛋白结构进行预测，分析其序列N端的锚蛋白重复序列及跨膜域，通过使用在线比对软件Clustal Omega对ApisPainless与DmelPainless的3个可变剪切型（isoform A、B、C）进行多序列比对，分析ApisPainless的可变剪切类型，通过构建昆虫TRP（transient receptor potential）离子通道超家族的进化树，分析ApisPainless的进化地位，并通过绘图直观地比较TRPA亚家族4个成员TRPA1、Painless、Pyrexia和Water witch的序列长短及N端锚蛋白重复序列的差异，使用实时定量荧光PCR技术，研究ApisPainless在1-4龄若虫以及成虫这5个不同发育时期的相对表达量，以及其在豌豆蚜成虫的触角、头、足和胸腹这4个不同组织中的相对表达量。【结果】预测并克隆得到ApisPainless全长序列，该基因的全长序列为2832 bp，编码943个氨基酸，蛋白结构分析表明ApisPainless具有8个锚蛋白重复序列以及6次跨膜结构，通过序列比较发现ApisPainless与DmelPainless isform A的相似性最高，达到42.3%。进化树分析结果表明昆虫TRP超家族分为TRPA、TRPC、TRPM、TRPN、TRPV、TRPP和TRPML 7个亚家族，而ApisPainless聚类于TRPA亚家族Painless一支，在TRPA亚家族TRPA1、Painless、Pyrexia和Water witch这4个成员中，TRPA1的序列最长，约为1200个氨基酸，其后依次是Water witch、Pyrexia和Painless，氨基酸数目约有920-1000个。从N端的锚蛋白重复序列上看，Water witch和Pyrexia约有9个重复序列，Painless约为8个，而TRPA1则高达15-16个，发育时期表达谱分析结果显示ApisPainless在豌豆蚜的各个发育阶段均有表达，其中以1龄若虫期表达量最高。组织表达谱分析结果显示，ApisPainless在豌豆蚜的触角、头、足和胸腹各组织中均有表达，其中以在触角中的表达量最高，足中的表达量居其次。【结论】克隆得到的ApisPainless是TRPA亚家族Painlss基因，其在触角及足中表达量高，推测其功能可能类似于果蝇的Painless，参与高温伤害识别、机械刺激识别及味觉探测等过程。

关键词：豌豆蚜、TRP通道、Painless、基因表达谱

分类号：TN911.23;R737.14;TP391.4

资助基金：国家重点基础研究发展计划（973计划）;国家自然科学基金

在线出版日期：2014-10-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：3799-3809