拟南芥液泡分拣蛋白AtVPS25调控植物生长素响应的功能分析

摘要：

【目的】鉴定生长素胁迫条件下纯合突变体vps25的表型，获得拟南芥液泡分选蛋白 AtVPS25的互作蛋白，并分析AtVPS25和其互作蛋白在生长素响应过程中的功能及其分子机制。【方法】根据“三引物法”鉴定突变体；通过观察拟南芥vps25突变体在外加生长素的培养基上的表型，鉴定AtVPS25的功能；以AtVPS25为诱饵蛋白，采用泛素分离系统筛选在拟南芥中与其互作的蛋白；利用酵母互作试验和双分子荧光互补试验（BiFC）验证AtVPS25与AtAIR12（for Auxin-Induced in Root cultures）的互作关系；鉴定AtVPS25和AtAIR12蛋白在植物细胞中的定位情况；采用Real-time PCR方法，分析在生长素处理条件下，部分生长素运输相关基因在拟南芥vps25突变体中的表达变化。【结果】Real-time PCR结果显示，10μmol·L-1 IAA处理条件下，在野生型拟南芥（WT）中，AtVPS25的表达量随着胁迫时间的增长而增高，并在12 h达到最高，约为0 h的40倍，证明AtVPS25受生长素处理的诱导表达。利用泛素分离系统筛库获得AtVPS25的互作蛋白AtAIR12、AtVPS25与AtAIR12全长蛋白序列的酵母双杂交试验证明AtVPS25与AtAIR12互作。亚细胞定位试验证明AtVPS25定位在细胞膜和细胞质中， AtAIR12定位在细胞膜及叶绿体膜上。BiFC（双分子荧光互补）试验结果显示，AtVPS25蛋白与AtAIR12蛋白互作，并且互作位点在细胞膜和细胞质中。突变体鉴定获得纯合突变体vps25。vps25在0.1 mg·L-1IAA条件下生长，表现为主根伸长受到抑制，并且相对同一条件下的WT的主根长度差异极显著（P＜0.01），而同时侧根数无明显差异，这与已报道的air12-1突变体在生长素处理条件下的表型相似。10μmol·L-1 IAA处理时，在WT背景条件下，AtAIR12的表达量对IAA响应明显，并且随着胁迫时间的增长而增高，在12 h时达到最高，约为0 h的80倍，证明10μmol·L-1 IAA处理条件下，WT中AtAIR12表达量的变化趋势与AtVPS25完全相同。同时在vps25突变体背景条件下，AtAIR12的表达相对于WT受到抑制，在0-24 h表达量无明显变化。此外，在 vps25突变体背景条件下，生长素输出载体基因 AtPIN2相对于 WT 中表达量降低，生长素输入载体基因AtLAX2相对于 WT中表达量提高。【结论】拟南芥液泡分拣蛋白基因AtVPS25受 IAA诱导表达，参与调控植物主根的发育，AtVPS25可以与生长素响应蛋白AtAIR12在细胞质和细胞膜上互作，AtVPS25调控部分生长素相关基因的表达，AtVPS25通过调控这些下游基因的表达影响生长素在根部的响应。AtVPS25与AtAIR12的调控机制需要进一步深入研究。

关键词：拟南芥、生长素运输、内体分选复合物、蛋白互作、泛素分离系统、双分子荧光互补试验

分类号：Q945.78;S511;S852.65

资助基金：国家转基因生物新品种培育重大专项;国家自然科学基金

在线出版日期：2014-09-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共12页

页码：3501-3512