牛巴贝斯虫DXS基因的克隆和真核表达

摘要：

【目的】顶质体是存在于包括疟原虫和巴贝斯虫在内的顶复门寄生虫的一种细胞器，在病原体中，它主要承载类异戊二烯前体和脂肪酸合成途径，异戊二烯五碳结构是有机体合成多种化合物的结构基础，对有机体生命活动至关重要，例如，在哺乳动物中成为胆固醇和类固醇激素的基本结构，在植物中参与合成类胡萝卜素。且存在于顶质体的类异戊二烯前体合成途径对于病原体的生命活动至关重要且不存在于人类和哺乳动物机体，这使其成为近年来人们研究抗原虫药物的焦点。有学者发现利用特异性阻断类异戊二烯代谢途径的药物可治疗疟疾。1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶（DXS）为该途径中的第一个限速酶。因此，针对牛巴贝斯虫的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶dxs基因进行克隆和序列分析，并对其进行真核表达和活性检测，以期获得具有活性的1-脱氧-5-磷酸 D-木酮糖合成酶，为进行针对该酶的特异性抑制剂的筛选奠定基础。【方法】首先采用反转录PCR技术从牛巴贝斯虫陕县株总RNA中扩增出DXS基因的全长cDNA，并对其进行克隆测序，对测序结果进行序列分析，将阳性克隆亚克隆至带荧光标签的真核表达载体，利用脂质体转染法将重组真核表达质粒转染至Hela细胞，利用倒置荧光显微镜观察转染细胞的表达情况，消化收集转染细胞，通过超声破碎后采用Western blot技术对DXS蛋白的表达情况进行检测，结合G418压力筛选以及有限稀释的方法对转染阳性细胞进行筛选，获得阳性单克隆细胞。在体外建立DXS酶反应体系，并利用液相质谱联用技术对表达产物的体外活性进行检测。【结果】扩增得到的DXS基因全长共2061 bp，共编码686个氨基酸，与GenBank上T2Bo株相应基因相似性达到98.0%。利用生物信息学方法对该蛋白质的二级结构进行分析发现，该酶具有3个结构域，分别是焦磷酸硫胺素结合区域；焦磷酸硫胺素嘧啶环结合区域；转酮醇酶C端区域，该酶属于常见的TPP依赖蛋白酶家族。通过倒置荧光显微镜观察，转染重组质粒后的Hela细胞呈现绿色荧光，Western blotting结果显示融合绿色荧光蛋白的DXS酶大小约为102 kD，表明构建的真核表达重组质粒在Hela细胞中进行了正确的表达。通过结合G418加压和有限稀释法筛选得到稳定转染重组质粒PEGFG-DXS的阳性单克隆细胞。利用质谱技术检测到在细胞粗提物与反应混合物反应后的产物中有分子量与 DOXP 相同的产物存在，在阳离子模式下 m/z=237，表明表达产物具有催化活性。【结论】成功的表达了具有活性的牛巴贝斯虫DXS酶，并对融合蛋白的活性进行了定性分析，为今后开展针对DXS酶的特异性化合物体外高通量筛选研究提供了材料。对研究针对DXS为靶标的抗原虫药物具有重要意义，为深入研究该酶的酶学性质和特异性抑制剂筛选奠定了基础。

关键词：牛巴贝斯、DXS、序列分析、真核表达

分类号：S85;R5

资助基金：国家肉牛牦牛产业技术体系建设专项资金CARS-38;中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金1610322011005

在线出版日期：2014-05-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1235-1242