人凝血因子Ⅸ乳腺特异表达载体的构建及细胞转染

摘要：

【目的】人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ，hFIX）是凝血过程中的关键因子，对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子Ⅸ乳腺表达载体，在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力，获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞，为克隆乳腺特异表达人凝血因子Ⅸ的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT-PCR试剂盒的说明书，从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出人凝血因子Ⅸ（human coagulation factor Ⅸ，hFIX）cDNA序列，利用PCR方法扩增牛生长激素(BGH) polyA序列，将hFIX的cDNA序列与BGH polyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-RC的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后，构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体 pbCSN2-hFIX-pA-RC。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织，利用组织块种植法培养猪乳腺细胞，并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞，进行染色体分析后，挑选含有正常染色体数目的细胞，通过脂质体法将表达载体导入，经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞，反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作，首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增，确定其性别。之后，利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞，并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选，对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存，为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定，人凝血因子ⅨcDNA和BGH PolyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中，获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX-pA-RC。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞，经实时定量PCR鉴定，hFIX有高效表达，证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异表达的能力，可以用于生产乳腺特异表达的动物。将构建的载体转入雌性猪胎儿成纤维细胞，经G418和红色荧光蛋白的表达筛选，成功获得hFIX转基因阳性细胞。【结论】pbCSN2-RC所含的牛β-酪蛋白启动子可以成功特异性诱导hFIX在猪乳腺细胞的特异表达，获得的hFIX转基因阳性猪胎儿成纤维细胞，为下一步通过体细胞克隆培育hFIX乳腺生物反应器奠定了基础。

关键词：人凝血因子Ⅸ、乳腺特异性表达载体、猪乳腺上皮细胞、猪胎儿成纤维细胞、转染

分类号：R39;R91

资助基金：国家“863”计划项目2009AA10Z111;农业部转基因生物新品种培育重大专项2008ZX08007-002;内蒙古自治区自然科学基因资助项目2009ZD02

在线出版日期：2014-04-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：769-778