巢式PCR快速检测西瓜细菌性果斑病菌

摘要：

[目的]建立nested-PCR方法,快速检测西瓜种子中的燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac),为西瓜细菌性果斑病(bacterial fruit blotch of watermelon,WFB)的防控提供技术支持.[方法]根据Aac BOX短重复序列的PCR产物设计两对引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2,建立以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,以5μL样品处理液于99℃高温裂解10 min,再放置冰上冷却5 min,以所释放病原DNA为模板进行PCR扩增,采用50μL反应体系:5μL10×PCRbuffer (25mmol·L-1 MgCl2),4μL dNTP (D4030RA,2.5 mmol·L-1),引物(5μmol·L-1)各3μL,0.4 μL Taq DNA酶(DR001B,5U·μL-1),通过退火温度优化,反应条件为:引物BX-L1/BX-R5各3μL进行第一轮扩增,95℃,2 min; 95℃,30s;65℃,45s;72℃,1 min; 35个循环;72℃,延伸7 min;取扩增后的产物1μL为模板,以引物BX-L1/BX-S-R2各3 μL进行第二轮扩增,95℃,2 min; 95℃,30 s,66℃,45 s,72℃,1 min,30个循环,72℃,7 min.在此条件下对梯度Aac菌悬液、模拟带菌种子提取液进行特异性、灵敏性及重复性检验,对不同带菌率的西瓜种子提取液进行检测.[结果]引物BX-L1/BX-R5和BX-L1/BX-S-R2在检测不同来源的Aac菌株时都产生了预期大小的片段,并且对其近源种燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种(A.avenae subsp.cattleyae)、魔芋假单胞菌(A.avenae subsp.konjaci)及其不相关菌株未扩增出目标片段.以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR,对Aac纯菌液和模拟带菌种子提取液的最低检测限4.7×101cfu/mL,比direct-PCR灵敏度高出1 000倍.当西瓜种子带菌率在0.1％-0.5％时,nested-PCR阳性检测率为66.7％;当种子带菌率为1％-10％时,nested-PCR的阳性检测率为83％-100％. [结论]以BX-L1/BX-R5为外侧引物,BX-L1/BX-S-R2为内侧引物的nested-PCR方法,能够快速、高效检测携带微量Aac的西瓜种子,检测结果重现性高.

关键词：西瓜细菌性果斑病、西瓜种子、PCR、检测

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资助基金：国家质检总局项目2009IK276

在线出版日期：2014-05-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：284-291