小麦胚乳14-3-3基因的克隆及其重组蛋白的原核表达

摘要：

[目的]克隆小麦籽粒胚乳14-3-3基因,并进行体外表达,为进一步研究其对籽粒生长发育的调控作用奠定基础.[方法]根据已有同源基因保守序列,设计插入限制性酶切位点的特异性扩增引物,采用RT-PCR方法扩增发育的小麦胚乳14-3-3基因,克隆测序后转入表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并进行纯化.[结果]从开花后灌浆13-15 d的小麦品种济麦22籽粒胚乳中克隆到1个14-3-3基因,序列分析表明为非ε型,含1个777 bp的开放阅读框,编码蛋白259 aa,分子量约29 kD.核苷酸序列分析表明与小麦、水稻、玉米、大麦、大豆等主要农作物和模式植物拟南芥的14-3-3基因有较高的同源性,最高达98％,编码蛋白氨基酸长度也一致(260aa左右)；在大肠杆菌中高效表达的重组蛋白约为30 kD,分子量大小与根据核苷酸序列推导的编码蛋白一致.从基因序列的同源性、编码蛋白的氨基酸长度、表达蛋白的分子量大小分析都说明克隆到的基因为14-3-3基因,并准确插入表达载体,得到了高效正确表达.将克隆的基因插入pET29c载体,热激转化大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RP,得到了高效表达,但主要以包涵体形式(80％)存在.对重组蛋白进行了纯化,可溶性重组蛋白利用S-蛋白琼脂糖树脂得到纯化的蛋白,包涵体重组蛋白经变性溶解、复性后,也利用S-蛋白琼脂耱树脂得到了高度纯化的重组蛋白.[结论]利用RT-PCR技术从发育的小麦胚乳中克隆到1个14-3-3基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白经过纯化得到了纯度较高的活性蛋白.

关键词：小麦、14-3-3蛋白、基因克隆、重组蛋白、原核表达

所属期刊栏目：45

分类号：S512.1(禾谷类作物)

资助基金：国家自然科学基金;转基因生物新品种培育科技重大专项;国家科技支撑计划;山东省农业良种产业化工程项目

在线出版日期：2012-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：2076-2084