利用二代测序技术对柔嫩艾美耳球虫T-DNA整合位点的分析及鉴定

摘要：

为建立一种适用于转基因球虫的快速且准确的分析T-DNA整合位点的方法,本研究利用二代测序技术对转基因柔嫩艾美耳球虫EtM2e虫株进行基因组重测序分析,基于嵌合体reads比对分析T-DNA的插入位点,通过T-DNA特有序列以及外源基因与球虫同源序列的测序深度进而分析T-DNA拷贝数,最后利用PCR扩增验证分析位点.结果表明:1)二代测序下机数据过滤后获得数据7.2 Gb,Q20为96.1％,Q30为89.2％,能够比对至柔嫩艾美耳球虫参考基因组的reads数为23 992 361 ×2,平均测序深度为80X,reads全基因覆盖结果表明整个染色体被覆盖的较为均匀,测序的随机性比较好,可以进行后续分析;2)比对至T-DNA序列的reads数为3 106和3036,平均测序深度为140X,嵌合体reads序列信息表明T-DNA只存在一个插入位点,位于HG994969.1:2 704213～2 705 255;3)T载体骨架特有序列卡那抗性基因的平均测序深度为67×,T-DNA特有序列EYFP基因的平均测序深度为85X,而T-DNA与球虫同源序列His4基因的5'调控区序列的平均测序深度为154X,Actin基因的3'调控区序列的平均测序深度为164X,同源序列的平均测序约为特有序列平均测序深度的2倍,这表明T-DNA为单拷贝,与发现一个插入位点的结果相符合;4)经PCR验证分析成功鉴定了该整合位点.转基因艾美耳球虫EtM2e虫株T-DNA整合位点的鉴定为后续转基因球虫鉴定提供了技术平台,也为球虫活载体疫苗的研发提供了一个潜在的靶位点.

关键词：T-DNA整合位点、柔嫩艾美耳球虫、二代测序技术、转基因

所属期刊栏目：28

分类号：S8559.1(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家重点研发计划;国家重点研发计划;国家自然科学基金;国家自然科学基金

在线出版日期：2023-07-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：183-190