人钾离子通道调节蛋白的原核表达及纯化

摘要：

目的:探讨人钾离子通道调节蛋白(KCNRG)的原核表达体系和纯化条件,为该蛋白的功能机制研究提供工具.方法:以pcDNA3.1-KCNRG-2ex重组质粒为模板,采用特异引物扩增KCNRG基因编码区.PCR产物双酶切后克隆入pET28a-MBP-His和pGEX-4T-1载体中.重组的pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG质粒转化Top10感受态细胞.鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化Rosetta(DE3)蛋白表达菌株,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot检测重组融合蛋白的表达.结果:PCR扩增产物长度为819 bp.经双酶切和测序,鉴定重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His和pGEX-4T-1-KCNRG构建成功.SDS-PAGE检测,KCNRG-MBP融合蛋白在菌液的上清中表达,KCNRG-GST融合蛋白主要以包涵体形式表达.Western blot检测,重组KCNRG-MBP蛋白和重组KCNRG-GST蛋白分别能被抗6×His抗体和抗GST抗体识别.经镍柱亲和层析纯化,获得纯化的KCNRG-MBP融合蛋白(凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度>90％).结论:成功构建重组质粒pET28a-KCNRG-MBP-His,并实现KCNRG-MBP融合蛋白的可溶性原核表达.

关键词：钾离子通道调节蛋白、原核表达、蛋白纯化

所属期刊栏目：35

分类号：R392

资助基金：北京市自然科学基金项目资助7113169

在线出版日期：2019-07-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1348-1353