miR-148a通过DNMT1调控MSCs向心肌分化的内在作用机制研究

摘要：

目的:验证DNA甲基转移酶1(DNMT1)是miR-148a直接调控的靶基因,探究miR-148a通过靶向DNMT1调控骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌分化的作用机制.方法:MSCs细胞经5′-氮胞苷(5′-aza)诱导向心肌分化后,使用miRNA芯片筛选出诱导前后表达差异的miRNAs.Targetscan软件分析异常表达的miR-148a的靶基因,将野生型或突变型DNMT1的3′-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游(DNMT1-wt或DNMT1-mut)并分别与miR-148a mimics(miR-148a模拟物)或scramble(miR-148a阴性对照)共转染,荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因DNMT1,qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-638 mimics和scramble后,对DNMT1的mRNA和蛋白表达的影响.构建miR-148a慢病毒质粒,分别在转染到MSCs后的第1、7、14和28天后检测miR-148a对GATA结合因子4(Gata-4)基因上游DNA调控序列CpG甲基化水平的影响、qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-148a慢病毒质粒后对心肌特异蛋白:球蛋白重链(MHC)和心脏肌钙蛋白T(cTnT)、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表达的影响,以及对心肌特异转录因子心脏特异性同源盒基因(Nkx2.5)和Gata-4表达的影响.结果:miRNA芯片筛选5′-aza诱导MSCs向心肌分化后表达异常的miRNAs,包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等,其中miR-148a表达明显上调.Targetscan、荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR验证DNMT1是miR-148a直接调控的靶基因.miR-148a慢病毒感染MSCs细胞,证实在转染的不同时间,Gata-4上游基因甲基化水平发生改变,且随着转染时间延长,Gata-4甲基化水平呈不断降低趋势,MSCs细胞内MHC和cTnT表达提高,CD90和CD29表达降低,Nkx2.5和Gata-4表达提高,MSCs细胞出现向心肌分化.结论:miR-148a可通过靶向调控DNMT1而调控MSCs细胞的向心肌分化.

关键词：miR-148a、DNMT1、骨髓间充质干细胞、向心肌分化

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分类号：R329.2(人体形态学)

资助基金：2015年重庆市第八批应用技术研究计划项目cstc2015jcyjA10042;2015年重庆市永川区科技计划项目Ycstc,2015nc5003

在线出版日期：2017-05-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：520-526,532