靶向小鼠TNF-α基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

摘要：

目的：构建靶向小鼠TNF-α基因的RNA干扰慢病毒载体，为RNA干扰基因治疗提供基础。方法：设计、合成3组靶向TNF-α基因的特异小干扰RNA （ siRNA）：siRNA1、siRNA2、siRNA3及阴性对照siRNA，体外转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7，用real-time PCR和ELISA法检测其对经脂多糖刺激的RAW264.7细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的影响。筛选出特异且抑制性高的siRNA，根据其序列设计合成寡核苷酸链，构建表达短发卡RNA（ shRNA）的重组慢病毒质粒并测序，经鉴定质粒与包装质粒共转染293 T细胞生产慢病毒颗粒，计算病毒颗粒滴度。结果：①siRNA1、siRNA2、siRNA3组的TNF-αmRNA相对表达量分别为0.24±0.01、0.16±0.02、0.19±0.01，与阴性对照0.95±0.02相比差别均具有统计学意义（ F＝531.3， P＜0.001）；与阴性对照相比，mRNA表达抑制率分别为74.26％、83.09％、79.93％。siRNA1、siRNA2、siRNA3及阴性对照组的IL-1βmRNA或IL-6 mRNA相对表达量之间差别无统计学意义（F＝0.981，P＝0.9807＞0.05；F＝0.739，P＝0.5867＞0.05）。②siRNA1、siRNA2、siRNA3的TNF-α蛋白表达分别为（23.95±1.21）、（17.27±1.46）、（19.07±1.57） ng／ml 与阴性对照的（35.37±2.93）ng／ml相比，差别均具有统计学意义（F＝18.1，P＝0.0006＜0.001）；与阴性对照相比，TNF-α蛋白表达抑制率分别为32.29％、51.16％、46.08％。③以siRNA2序列设计、合成寡核苷酸链，构建重组慢病毒穿梭质粒，其PCR产物电泳结果为343 bp，空载体PCR产物306 bp；DNA测序显示pGCSIL-GFP-shRNA测序反应中断，但已显示部分插入序列。④转染后的293 T细胞，生长良好，荧光表达强，慢病毒滴度为2×106 TU／μl。结论：靶向小鼠TNF-α基因RNAi慢病毒载体构建成功。

关键词：RNA干扰、慢病毒载体、巨噬细胞、肿瘤坏死因子-α

分类号：R392-33

资助基金：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目2006BS03005。

在线出版日期：2014-08-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：927-932