粉尘螨变应原第2组分基因的原核表达及生物信息学分析

摘要：

目的:克隆并原核表达粉尘螨变应原第2组分重组蛋白,鉴定其变应原性,分析其分子特征,为制备用于临床诊治的变应原奠定基础.方法:提取粉尘螨Total RNA,根据国际基因库 (AB195580)设计并合成引物,经RT-PCR合成Der f 2全长基因,与pMD19-T 载体连接后,热转化至E.coli JM109;将测序正确的Der f 2基因与pET28a(+) Vector连接,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达;经镍琼脂糖凝胶FF亲和柱层析,收集各阶段洗脱峰用梯度透析法进行复性,Western blot鉴定重组蛋白的变应原性.用生物信息学软件预测其理化性质、空间结构,并构建分子进化树.结果:RT-PCR成功扩增获得目的基因Der f 2,全长441 bp,与参考序列同源性99.3%.将构建的pET28a(+)-Der f 2质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达,SDS-PAGE电泳显示全细胞和沉淀物中均有蛋白表达.亲和柱层析后获得约3 86 mg重组蛋白纯品,Western blot分析表明其可与哮喘患儿血清IgE发生特异性结合.去除信号肽序列(1～17氨基酸)后,重组蛋白由129个氨基酸组成,相对分子质量为14.076,二级结构由延伸主链(30.82%),无规则卷曲(49.32%),α螺旋(19.86%)组成.该变应原可能位于线粒体,属ML域家族.序列比对显示,粉尘螨和屋尘螨、微角尘螨、梅氏嗜霉螨的相似度依次为88%、96%、83%,此四种螨在上述蜱螨变应原第2组分构建的分子进化树中聚成一簇,支持率达100%.结论:粉尘螨变应原第2组分原核表达获得成功,纯化后获得具有变应原性的重组蛋白,为进一步规模生产该变应原并用于临床诊治奠定基础;生物信息学分析初步获得了该变应原的分子特征,为进一步实验室验证指明方向.

关键词：粉尘螨、变应原、原核表达、生物信息学

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分类号：R184.39(流行病学与防疫)

资助基金：国家自然科学基金30660166、NSFC81001330;盐城市科技发展计划YK2008079;江苏省卫生厅招标课题Z200914;江苏省卫生职业技术教育研究立项课题J200907;江苏省"六大人才高峰"第六批项目资助

在线出版日期：2011-07-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：533-539