GAD65基因特异siRNA的构建和功能检测

摘要：

目的：构建GAD65基因特异的siRNA并检测体外功能。方法应用RT－PCR方法克隆大鼠GAD65基因、测序、重组病毒包装检测体外功能。针对GAD65基因的编码区，设计3条 siRNA片段及一条对照片段，将其分别亚克隆于siRNA的慢病毒表达载体并小量包装获得病毒颗粒（ LV－GFP－siRNA－rGAD65）；用siRNA病毒颗粒感染GAD65过表达的293细胞，检测GAD65表达情况，从中筛选出高效特异的siRNA。大量包装特异的siRNA病毒颗粒，在体外感染培养的大脑皮质细胞，在体内注射到SD大鼠的苍白球内侧部，检测rGAD65的表达水平，观察 siRNA的功能。结果应用RT－PCR方法克隆rGAD65基因，其序列与 GenBank 中的基因序列几乎一致（99．72％），包装病毒后在293细胞中过表达。筛选出针对rGAD65的高效特异的siRNA，在GAD65基因的沉默效率可达到66％。在体外、体内分别应用Western印迹检测感染了LV－GFP－siRNA3－rGAD65的大脑皮质细胞和定点注射了LV－GFP－siRNA3－rGAD65的大鼠GPi。结论成功克隆rGAD65基因，设计、筛选出高效特异的 siRNA，并证明这种 siRNA在体内和体外均能有效地沉默rGAD65的表达。

关键词：谷氨酸脱羧酶、小干扰RNA、基因沉默

分类号：R742.5(神经病学与精神病学)

在线出版日期：2015-09-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共3页

页码：4465-4467