PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及稳定感染HepG2单克隆细胞株的建立

摘要：

目的 构建PRL -3基因RNA干扰慢病毒载体并建立被稳定感染的HepG2单克隆细胞株.方法 设计PRL -3基因特异性RNAi靶序列,合成靶序列的DNA oligo,退火形成双链DNA,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL- GFP线性化载体连接,产生重组慢病毒质粒LV - PRL3 - siRNA,转化感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并测序鉴定.用Lipofectamine 2000将LV - PRL3 -siRNA、pHelper 1.0和pHelper 2.0这3种质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,经孔稀释法,测定病毒滴度.重组慢病毒感染肝癌HepG2细胞,进行RealTime - PCR和Western - Blot验证PRL -3基因的沉默效果,筛选出最佳干扰序列组及阴性对照组的单克隆细胞株.结果 成功构建PRL -3基因RNA干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为6E+8 Tu·mL-.重组慢病毒对HepG2细胞PRL -3基因表达有明显沉默作用,其中第一干扰序列效果最明显.筛选出最佳干扰序列组及阴性对照组的单克隆肝癌细胞株.结论 成功构建人PRL -3基因特异性的慢病毒干扰载体,并筛选出最佳干扰序列组及阴性对照组的单克隆肝癌细胞株.

关键词：RNA干扰、慢病毒、PRL-3基因、肝细胞癌

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分类号：R735.7;R965.2(肿瘤学)

资助基金：国家自然科学基金资助项目30571769;国家973重点基础研究发展规划基金资助项目2009CB522404

在线出版日期：2012-03-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：862-866