受精卵注射CRISPR/Cas9系统制备基因编辑子午岭黑山羊技术体系的建立

摘要：

受精卵注射CRISPR/Cas9系统是制备基因编辑动物的有效方法,其中受精卵收集效率、显微注射胚胎存活率及胚胎移植受体妊娠率是关键影响因素.以子午岭黑山羊为研究对象探讨了情期内不同时间点放置CIDR对超数排卵的影响;分析了胚胎供体和受体发情停止时间差异对胚胎移植妊娠率的影响;设计了3个打靶肌肉生长抑制素基因(MSTN)的小向导RNA (sgRNA),并优化了CRISPR/Cas9系统显微注射参数.结果表明,胚胎供体发情停止后第4天放置阴道栓可有效提高黄体数(15.25±3.69)和受精卵数量(13.875±4.015);利用微量注射泵将Cas9mRNA (60 ng/μL)和打靶MSTN基因的sgRNAs (60 ng/μL)混合液注射到受精卵胞质内,注射参数Pi,Ti和Pc分别为300,0.5和60,注射24 h后胚胎分裂率为76.79％.胚胎移植时受体发情结束时间晚于供体发情结束时间12～16 h妊娠率最高(38.46％).本研究共得到19个存活的个体,经TA克隆测序分析,所有个体MST打靶位点上均发现碱基的插入或缺失.综上,本研究以子午岭黑山羊为例,建立了受精卵注射CRISPR/Cas9系统制备基因编辑山羊的技术体系,为利用CRISPR/Cas9技术进行山羊的遗传改造奠定了技术基础.

关键词：子午岭黑山羊、MSTN、CRISPR/Cas9、遗传修饰、受精卵注射

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资助基金：陕西省地方重大专项批注号:2014KTDZ02-01;陕西省科技厅农业科技攻关项目批注号:2011K01-05;国家自然科学基金批注号:31460282

在线出版日期：2018-05-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：297-306