构建重组表达质粒pBV220/mhNT-4及mhNT-4在大肠杆菌中的表达

摘要：

利用基因重组技术将mhNT-4亚克隆到表达载体pBV220,构建重组表达质粒pBV220/mhNT-4,诱导表达mhNT-4成熟蛋白,鉴定mhNT-4的生物活性.将经鉴定的pGEM-TEasy/mhNT-4克隆用限制性内切酶EcoRI,BamHI消化.琼脂糖凝胶电泳回收片断.酶切原核高表达载体pBV220,用限制性内切酶EcoRI,BamHI消化,琼脂糖凝胶电泳回收线性化载体.用T4DNA连接酶连结两个回收片断,构建重组质粒pBV220/mhNT-4.限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒.经鉴定的重组质粒pBV220/mhNT-4转染大肠杆菌DH5α.温度诱导表达mhNT-4蛋白.SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳技术分离表达的mhNT-4蛋白.制备8～9d鸡胚,分离并培养背根神经节(DRG)细胞.分别加入回收的表达蛋白和牛血清白蛋白,培养鸡胚背根神经节DRG细胞,检测mhNT-4生物活性.重组表达质粒pBV220/mhNT-4构建正确,表达框架未发生改变.成功诱导表达,分离了mhNT-4成熟蛋白.表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织快周缘向四周呈放射状长出,对照组未见神经突起长出.mhNT-4成熟蛋白具有良好的生物活性.本研究为进一步开展mhNT-4基因治疗青光眼提供了资料.

关键词：人神经营养素-4成熟蛋白基因(mhNT-4)、基因重组、表达载体、生物活性

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分类号：R96(药理学)

资助基金：首都医学发展科研基金2002-1014;美国中华医学基金82413

在线出版日期：2008-12-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：263-268