10.3969/j.issn.1004-406X.2020.05.07
人尿源干细胞外泌体对退变髓核细胞生物学功能的影响
目的:探讨人尿源干细胞外泌体(USC-Exos)对退变髓核细胞(NPCs)生物学功能的影响.方法:从健康成人尿液中获得人尿源干细胞(USCs)并进行体外培养,通过成骨、成软骨、成脂诱导分化及蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)技术对所提取细胞进行鉴定.使用USCs完全培养基培养USCs 48h后采用差速离心法从培养基中提取外泌体,应用电子显微镜、粒径分析及WB技术对USC-Exos进行形态、直径及表面标志物检测.从腰椎间盘突出症患者术中摘除的髓核中提取NPCs,并培养至P6.以加入50μg/ml USC-Exos干预的P6NPCs为实验组,以50μg/ml未培养过细胞的USCs完全培养基离心沉淀物干预的P6 NPCs为对照组,分别在于预后1～6d使用CCK-8法检测NPCs增殖情况.使用PKH26荧光染料标记USC-Exos,并用标记后的USC-Exos干预P6 NPCs,12h后在激光共聚焦显微镜下观察NPCs对USC-Exos的摄取情况.两组在干预后48h进行β-半乳糖苷酶衰老染色检测NPCs衰老比例,免疫荧光染色观察蛋白聚糖(ACAN)、Ⅱ型胶原(COL2)的表达.干预后3d、5d、7d时用RT-PCR和WB检测两组NPCs中ACAN、COL2、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)、多肿瘤抑制基因P16(P16)的mRNA及对应蛋白的表达量,对两组ACAN、COL2、TIMP1、P16基因的相对表达量进行比较,P＜0.05为有统计学差异.结果:从人尿中提取的细胞具有干细胞特性,传代培养后可从中提取粒径为50～100nm的椭圆形囊泡结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白,符合Exos特性.P6 NPCs经USC-Exos干预后细胞增殖速度变快.经PKH26标记的USC-Exos可被NPCs摄取.干预后48h实验组衰老细胞比例[(13.8±1.4)％]低于对照组[(19.6±2.4)％],ACAN、COL2的荧光强度高于对照组.干预后3d、5d、7d时,实验组细胞中ACAN、COL2、TIMP1 mRNA及对应蛋白的相对表达量较对照组显著性升高(P＜0.05),P16基因mRNA及对应蛋白的相对表达量较对照组显著性降低(P＜0.05),而同组内不同时间点比较无显著性差异.结论:USC-Exos在体外条件下可促进退变NPCs的增殖,提高退变NPCs中ACAN、COL2、TIMP1 mRNA及对应蛋白的表达,降低P16 mRNA及对应蛋白的表达.
人尿源干细胞、髓核细胞、外泌体、细胞外基质
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R681.5;Q813.1(骨科学（运动系疾病、矫形外科学）)
国家自然科学基金资助项目;山东省自然科学基金;中国博士后基金;青岛市应用基础研究计划;泰山学者青年专家工程资助
2020-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共10页
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