酸环境对大鼠髓核细胞自噬及功能的影响

摘要：

目的:观察酸环境下髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPCs)中卵巢癌G蛋白偶联受体1(ovarian cancer G-protein-coupled receptor 1,OGR1)和自噬相关蛋白LC3的表达水平,探讨自噬激活机制,初步分析其对细胞功能的影响.方法:取SD大鼠正常髓核组织,分离培养NPCs,甲苯胺蓝、阿利新染色和Ⅱ型胶原免疫荧光检测鉴定NPCs.扩增培养NPCs,取第2代NPCs,在pH值为6.2、6.4、6.8、7.0、7.2和7.4的培养基中培养24h,免疫荧光观察NPCs中OGR1的表达情况,Western blotting检查细胞中OGR1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平;在pH值为6.4的培养基中培养0、3h、6h、12h、24h、48h后,采用Western blotting检测NPCs中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表达水平.构建3个不同靶点的OGR1干扰序列,检测最合适滴度慢病毒,用最适滴度慢病毒转染NPCs,使用Western blotting和Real-time PCR检测不同干扰序列的沉默效果,选取最适干扰系列构建OGR1-shRNA慢病毒载体.取第2代NPCs,分为4组:正常组(DMEM培养基)、pH值6.4培养基组(空白组)、pH值6.4培养基空载体组(空载体组)、pH值6.4培养基OGR 1-shRNA慢病毒转染组(转染组),培养24h后用Western blot-ting检测LC3-Ⅱ和p62蛋白表达水平;Alcian染色观察NPCs中蛋白多糖的表达情况.结果:(1)分离培养的细胞高表达蛋白多糖和Ⅱ型胶原,符合NPCs表型.(2)OGR1蛋白表达水平与培养基pH值相关,pH值＜7.0时,OGR1和LC3-Ⅱ蛋白表达水平显著性升高(P＜0.05),pH值6.4时表达量最高.(3)在pH值6.4的培养基中培养时,细胞中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表达量与培养时间有关,24h时达高峰,48h仍较高.(4)3个干扰序列对OGR1均有沉默作用,与对照组比较有显著性差异(P＜0.05),OGR 1-shRNA1沉默效果最佳.(5)转染组细胞在pH值6.4的培养基中培养24h后,LC3-Ⅱ表达水平显著性低于空载体组(P＜0.05);p62表达水平显著性高于空载体组(P＜0.05);蛋白多糖的表达低于空载体组(P＜0.05).结论:酸环境可促进大鼠NPCs中OGR1蛋白表达和自噬水平升高,OGR1介导了细胞自噬的激活,并影响NPCs的生物学功能.

关键词：髓核细胞、酸环境、卵巢癌G蛋白偶联受体1、自噬、细胞功能、大鼠

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分类号：Q813.5;R681.5(生物工程学(生物技术))

资助基金：国家自然科学青年基金项目81702177;国家自然科学面上项目81771501

在线出版日期：2019-09-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：641-649