TNF-α-shRNA对结核菌素诱导破骨细胞形成的影响

摘要：

目的:构建靶向肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)基因的短发卡RNA (short hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对结核菌素(purified protein derivative,PPD)诱导破骨细胞形成的影响.方法:双酶切法构建TNF-α-shRNA,经脂质体转染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞),通过荧光显微镜观察TNF-α-shRNA的转染情况;采用逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)观察转染前及转染后第1、3、5、7天TNF-α基因的表达情况;以RAW264.7细胞为空白组、RAW264.7细胞+1IU· ml-1PPD为对照组、RAW264.7细胞+TNF-α-shRNA+1 IU· ml-1pPD为转染观察组、RAW264.7细胞+空载质粒+1 IU· ml-TPD为阴性转染组,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)检测各组第3天TNF-α基因和蛋白的相对表达量;采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)计数各组第7天破骨细胞形成的数量.结果:TNF-α-shRNA经脂质体成功转染RAW264.7细胞,转染效率达70％～80％.RT-PCR显示转染后第3天TNF-α基因的表达最少,第5天次之,第1天、第7天和转染前比较差异不大.转染后第3天转染观察组TNF-α基因的相对表达量为0.46±0.03,同时间点空白组为1.00±0.00,对照组为1.43±0.09,阴性转染组为1.38±0.06.转染后第3天转染观察组TNF-α蛋白的相对表达量为55.34±0.82,同时间点空白组为59.13±1.43,对照组为82.72±1.84,阴性转染组为84.62±0.97.转染后第7天转染观察组破骨细胞形成的数量为19.33±1.53个,同时间点空白组为5.67±1.53个,对照组为56.67±3.79个,阴性转染组为59.67±3.51个.转染观察组的TNF-α基因和蛋白的相对表达量及破骨细胞数量与空白组、对照组、阴性转染组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);空白组与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);对照组与阴性转染组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:TNF-α-shRNA可以特异性地沉默RAW264.7细胞内TNF-α基因的表达,使TNF-α的产生减少,抑制PPD诱导的破骨细胞形成.

关键词：基因敲除技术、肿瘤坏死因子、结核菌素、破骨细胞

所属期刊栏目：28

分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家自然科学基金地区项目81460335;宁夏自然科学基金项目NZ17147

在线出版日期：2018-10-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：741-747