基于novel-miR1检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增方法的建立和应用

摘要：

目的 建立检测家兔豆状囊尾蚴感染的滚环扩增(RCA)方法.方法 以家兔血清中豆状囊尾蚴来源的novel-miR1为诊断靶标,设计连接序列和锁式探针,并对连接序列和锁式探针的比例、反应时间、酶用量、dNTP用量以及扩增反应时间等5个重要条件进行优化,建立检测豆状囊尾蚴感染的RCA方法.将novel-miR1标准品倍比稀释为1 fmol/L至100 nmol/L的9个不同浓度的样品,评价RCA方法的灵敏度.用优化后的RCA方法分别检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA各20份(实验室保存样品),并通过受试者工作特征(ROC)曲线分析其敏感性和特异性.20只雌性家兔每只经口感染1 000个豆状带绦虫虫卵,采集感染前和感染后每个月的家兔血样制备血清miRNA,用优化后的RCA方法进行检测,评价其应用效果.结果 电泳结果显示,RCA扩增产物的DNA停留在加样孔中,形成一条明亮条带.反应条件优化试验结果显示,连接序列浓度为2μmol/L、锁式探针浓度为1μmol/L(连接序列和锁式探针的比为2:1)、T4 DNA连接酶为350 U、连接180 min时连接效率最高.在100μl的扩增体系中,dNTP浓度为0.5 μmol/L,扩增240 min时,RCA扩增效果最佳.优化后RCA的最低检测浓度为10 pmoI/L.RCA检测健康家兔和豆状囊尾蚴感染家兔血清miRNA样品的平均荧光值分别为53.298±1.707和97.498±5.892,差异有统计学意义(t=7.206,P＜0.01).ROC分析结果显示,当阳性临界值为61.69时,RCA方法的敏感性和特异性均为95％,AUC为0.955 0,似然比为19.00.RCA检测豆状囊尾蚴感染后不同时间的家兔血清miRNA结果显示,20份感染前的血清中19份检测结果为阴性,1份为阳性;感染后1个月的血清中,17份为阳性,2份为疑似,1份为阴性;感染后2个月的血清,1份为阴性,其余为阳性;感染后3个月的血清,3份为阴性,其余为阳性.结论 建立了检测家兔豆状囊尾蚴感染的RCA方法,该方法在豆状囊尾蚴感染后3个月内的家兔血清中检出novel-miR1,具有良好的应用潜力..

关键词：豆状囊尾蚴病、novel-miR1、滚环扩增

所属期刊栏目：41

分类号：R532.39(寄生虫病)

在线出版日期：2023-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：294-299