田鼠巴贝虫肽基脯氨酸异构酶基因的重组表达及功能分析

摘要：

目的 表达田鼠巴贝虫重组肽基脯氨酸异构酶(BmPPIase)基因并分析其功能.方法 利用生物信息学方法筛选分析BmPPIase基因信息.通过BmPPIase全基因合成获得目的片段BmPPIase,构建重组质粒pET28a-BmPPIase,转入大肠埃希菌BL21感受态细胞中进行原核表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析BmPPIase重组蛋白表达情况,镍柱亲和纯化重组蛋白,小牛血清蛋白(BSA)法测定重组蛋白浓度.取BmPPIase重组蛋白在新西兰白兔背部多点免疫4次(第1、15、29、43天,每次1.5 mg),首次免疫后第53天颈动脉采血,ELISA鉴定其特异性多克隆抗体效价.蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析多克隆抗体的免疫原性.免疫荧光定位实验判断PPIase在田鼠巴贝虫虫体的位置.体外抑虫实验分别设置BmPPIase重组蛋白终浓度500、250、100、50、10μg/ml组,以及重组剪接因子1组(无关蛋白对照组,500、250、100、50、10μg/ml)、BSA组、空白对照组,各组加入小鼠感染红细胞孵育48 h,经溴化乙锭标记后,采用流式细胞仪检测感染红细胞的比例,分析重组蛋白在田鼠巴贝虫感染宿主红细胞过程中的作用.结果 生物信息学分析结果显示,BmPPIase为亲环素类PPIases;在牛巴贝虫、泰勒虫、人芽囊原虫、疟原虫中均存在同源蛋白.重组质粒酶切结果显示,插入的基因大小为531 bp,与预期相符,测序结果正确.SDS-PAGE分析结果显示,BmPPIase重组蛋白为可溶性蛋白,相对分子质量为19 000,经纯化后获得蛋白浓度为1.5mg/ml.ELISA检测结果显示,抗BmPPIase重组蛋白特异性多克隆抗体效价＞1:80 000.Western blotting分析结果显示,制备的抗BmPPIase多抗可特异识别重组蛋白.免疫荧光定位实验结果显示,BmPPIase分布在田鼠巴贝虫虫体表面,属于分泌蛋白.体外抑虫实验结果显示,重组BmPPIase对虫体入侵小鼠红细胞存在一定程度的抑制作用:BmPPIase重组蛋白浓度为500 μg/ml时,相对染虫率为(47.0±1.2)％;随着重组蛋白浓度的降低,抑虫作用逐渐减弱,250、100、50 μg/ml时相对染虫率分别为(64.0±0.3)％、(78.0±1.9)％和(82.0±0.25)％;至 10 μg/ml时相对染虫率为(93.0±0.22)％,已无明显抑虫作用.结论 BmPPIase属于分泌蛋白,分布于虫体表面;可在体外明显抑制田鼠巴贝虫感染红细胞.

关键词：巴贝虫病、田鼠巴贝虫、肽基脯氨酸异构酶、荧光定位、体外抑虫实验

所属期刊栏目：41

分类号：R382.9(医学寄生虫学)

资助基金：上海市自然科学基金;上海市卫生健康委员会面上基金;国家科技基础条件平台建设计划

在线出版日期：2023-04-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：29-35