刚地弓形虫RH株速殖子体外入侵小鼠巨噬细胞系感染模型的构建

摘要：

目的 建立刚地弓形虫(简称弓形虫)RH株速殖子体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,确定体外快速高效培养速殖子的方法.方法 弓形虫RH株速殖子经昆明小鼠传代3次后,经5μm滤膜纯化计数后,与小鼠巨噬细胞RAW264.7、人包皮成纤维(HFF)细胞共培养.RAW264.7细胞与虫体数量比例分别为20︰1、10︰ 1、1︰1、1︰5,HFF细胞与虫体比例为1︰1,设无虫对照组.分别于培养后10 min、0.5h、1 h、2h、4h、8h、12 h、24 h、32 h、48 h时间点取样,高倍镜下观察共培养情况,瑞-吉氏染色观察速殖子的黏附入侵细胞情况.将速殖子以1.5×106个/瓶接种于RAW264.7 T25细胞培养瓶中共培养,待80％假包囊破裂后,收集速殖子并计数,计算速殖子产率.用0.4％台盼蓝染液染色后,计算培养体系的活虫率.回收的弓形虫速殖子继续感染新的RAW264.7细胞,将每代细胞中收集的速殖子以1×106个/只接种5只健康雌性昆明小鼠,同时以等量的第3代速殖子接种5只健康雌性昆明小鼠作为对照,记录每代小鼠的存活时间.应用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析.结果 当RAW264.7细胞与虫体比例大于10︰1时,共培养24h时可见细胞边界不清,胞质增加,出现大量小泡;共培养30 h时细胞大量死亡消失,未观察到游离弓形虫;当细胞与虫体比例小于或等于1 ︰ 1时,共培养24 h时内胞质可见细密小颗粒,未见小泡;共培养30 h时假包囊破裂达90％以上,大量速殖子被释放至培养液中,可观察到速殖子体外发育的完整过程.速殖子与RAW264.7细胞以1 ︰ 1的比例共培养0.5～1 h,约80％的速殖子侵入细胞,虫体可进入胞质和胞核,2～4 h后假包囊开始形成,8h可见菊花状假包囊;24h后假包囊开始破裂,32h后细胞悬浮不贴壁,大部分假包囊破裂并释放出游离速殖子,虫体形态好,每瓶收获弓形虫速殖子6 x 108个,平均活虫率在92％以上.速殖子与HFF细胞共培养,2～4 h虫体基本入侵细胞;8h后速殖子开始分裂增殖;共培养24h,可见速殖子分裂成菊花状;36h后细胞开始涨破,释放出的速殖子开始新一轮入侵HFF细胞.体外培养各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为3.94～4.10 d,经与昆明小鼠体内传代复毒虫株相比毒力未见减弱.结论 采用小鼠巨噬细胞RAW264.7可在体外培养快速获得大量弓形虫RH株速殖子,产率为体内培养方法的400倍,且虫体毒力与体内培养方法相当,培养时间和产率上也均优于HFF细胞系.

关键词：刚地弓形虫;速殖子;鼠巨噬细胞;人包皮成纤维细胞

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分类号：R382.5(医学寄生虫学)

资助基金：山东省自然科学基金联合专项;山东省医药卫生科技发展计划项目;山东省泰山学者工程项目;国家自然科学基金;山东第一医科大学学术提升计划项目;山东省医学科学院医药卫生科技创新工程

在线出版日期：2021-10-13（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：494-500,504