细粒棘球蚴原头节β4微管蛋白的可溶性表达、纯化及生物信息学分析
目的 对细粒棘球蚴原头节的β4微管蛋白(EgTub4)基因进行生物信息学预测和分析,并探索该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的最佳诱导条件,纯化目标蛋白. 方法 采用ProtParam、SMART、Predictprotein和Swiss-model软件分析EgTub4蛋白的理化性质和结构,采用SignalP4.1软件进行信号肽预测.提取细粒棘球蚴原头节的总RNA,并反转录成cDNA,PCR扩增EgTub4基因,构建原核重组表达载体pET28a-EgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,进行酶切鉴定,并测序.探索重组蛋白rEgTub4可溶性表达的最佳诱导条件[表达载体、诱导温度(T)、诱导剂(IPTG)浓度、诱导时间(t)和培养基类型].利用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析(Western blotting).结果 经生物信息学分析预测EgTub4蛋白理论等电点(pl)值为4.79,理论相对分子质量(Mr)为49 700;EgTub4不含信号肽,含有3个结构域,分别为微管蛋白GTPase结构域、C末端结构域和卷曲螺旋区.成功构建了重组质粒pET28a-EgTub4、pET30a-EgTub4和pET32a-EgTub4,经双酶切后,均可得到与目的基因相对分子质量相符的片段,测序正确.经Westem blotting分析,在表达质粒pET28a(+)、pET30a(+)和pET32a(+)中重组蛋白分别为Mr56 000、60 000、68 000.EgTub4基因在pET28a(+)中表达时不可溶,主要以包涵体形式存在,需要在变性条件下进行纯化.而在pET30a(+)和pET32a(+)中表达时均部分可溶,可以在非变性条件下进行纯化.综合考虑,本研究最终选择pET30a(+)作为EgTub4基因的表达载体.目标蛋白可溶性表达的优化条件为:T=25℃、[IPTG]=0.01 mmol/L、t=10h、2×YT培养液.最佳洗杂咪唑浓度为150 mmol/L,洗脱咪唑浓度为500 mmol/L.Western blotting分析结果显示,纯化的蛋白均能与β-微管蛋白抗体及His-Tag标签抗体反应,条带大小符合预期,约Mr 60 000. 结论 对EgTub4进行了生物信息学预测、分析和表达,得到该基因在大肠埃希菌中可溶性表达的最佳诱导条件,纯化目标蛋白.
细粒棘球蚴、原头节、β4微管蛋白、原核表达、可溶性、生物信息学
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R383.33(医学寄生虫学)
国家自然科学基金81401691;上海市卫计委面上项目201540170;寄生虫病所防治技术储备科研基金CB-16004
2018-08-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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